陈洪艳，李忻红

（1.辽宁中医药大学，沈阳110032；2.辽宁中医药大学附属医院，沈阳110032）

银屑病，中医称之为“白疕”，属于多基因遗传的疾病，可由多种激发因素诱发。其病生理机制主要为表皮增生分化的异常和免疫系统的激活。白疕合剂为我科多年临床经验总结制成的院内制剂，临床治疗寻常性银屑病患者取得满意疗效，进展期效果尤为显著[1]。本研究以银屑病小鼠模型为研究对象，观察中药白疕合剂对小鼠T淋巴细胞凋亡及角质形成细胞抑制的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂 白疕合剂（院内中药制剂，制剂号：Z05010105，主要组成：生地、白茅根、丹参、金银花、板蓝根、白花蛇舌草等九味药）；消银颗粒（陕西康惠制药有限公司，制剂号：Z20000019）；苯甲酸雌二醇注射液（上海通用药业股份有限公司）；兔抗小鼠增殖细胞核抗原（PCNA）一抗（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-0754R）；免疫组化SP试剂盒（北京博奥森生物技术科技有限公司，批号：SP-0024）等。

1.2 动物 昆明种雌性小鼠，鼠龄6～8周，每只体质量18～22g，共72只（中国医科大学实验动物中心）。

1.3 仪器 超薄切片机：LKBV型，瑞典LKB公司、透射电子显微镜：JEM-100CXII型，日本电子公司；电热恒温培养箱，HH·B11·500型，上海跃进医疗器械厂生产；微量移液器，美国热电公司生产；脱水机，LEICA 300型，德国徕卡公司生产；石蜡包埋机，EG1150型，德国徕卡公司生产；切片机，LEICARM2235型，德国徕卡公司生产；数码显微镜，OLYMPUS BX41型。日本OLYMPUS公司生产；生物显微镜，CHA型，日本OLYMPUS公司生产等。

1.4 方法

1.4.1 动物分组 雌性昆明小鼠72只，按随机数字表分为6组，每组12只：空白对照组、阴性对照组、白疕合剂高、中、低剂量组、消银颗粒组。

1.4.2 动物给药剂量 用药量按成人100 g/70 kg每日计算，小鼠给药剂量按照人与小鼠体表面积比例进行换算，得出小鼠给药剂量为0.115 g/（10 g·d）。因此设定的白疕合剂高、中、低剂量组灌胃浓度分别为2.3、1.15、0.575g/mL，给药量为0.2mL/（10g·d）。消银颗粒组灌胃量0.2g/（10 g·d），模型组小鼠每日以等量生理盐水灌胃，空白对照组正常喂养，连续给药28 d。

1.4.3 银屑病小鼠模型制备 将除空白对照组以外的60只小鼠，腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液0.2 mg/10 g，1次/d，连续 3 d，使所有小鼠处于雌激素期。各组动物分别称质量，按体质量灌饲器灌胃给药，1次/d，连用4周。根据体质量变化，随时调整灌药剂量。

1.4.4 实验方法与指标检测

1.4.4.1 透射电镜下观察脾脏中淋巴细胞凋亡 颈椎脱位处死小鼠，无菌取脾，常规制备脾细胞悬液，1500 r/min，离心10 min，去上清。加入2 mL 2.5%戊二醛固定，然后经过常规包埋、切片、醋酸铀-柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察并摄片。

1.4.4.2 SP免疫组化法观察小鼠人角质形成细胞（KC）细胞增殖核抗原PCNA的抑制作用 末次给药1 h后，各组随机抽取8只小鼠用于免疫组化法检测PCNA蛋白表达水平，取各组小鼠阴道上皮组织，用10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规切片、脱蜡、抗原修复，然后采用免疫组化SP法进行PCNA蛋白表达水平检测。切片染色后，光镜下选择染色良好区域，应用Leica Q550CW图像采集和分析系统，测定单位面积阳性细胞表达的灰度平均值作为其表达情况，由于该分析系统将白色灰度值设定为255，将黑色灰度值设定为0，故灰度值越高，表达水平越低。

1.5 统计学分析 采用SPSS15.0统计软件进行数据处理和统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多样本均数比较应用单因素方差分析（Oneway ANOVA），样本均数间的比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白疕合剂及消银颗粒对小鼠T淋巴细胞凋亡的诱导作用 与空白对照组相比，白疕合剂高、中、低剂量组均能出现细胞凋亡，电镜下观察正常组能见淋巴细胞核大圆型，异染色质分布在核的周边，核仁明显，中药高剂量、中剂量、低剂量组较空白组比较出现凋亡小体，以高剂量最为明显，消银颗粒可见少量凋亡小体。结果见图1。

图1 白疕合剂及消银颗粒对小鼠T淋巴细胞凋亡的影响（醋酸铀、柠檬酸铅双染色×10000倍）

2.2 白疕合剂对小鼠阴道组织中PCNA表达的影响 模型组与空白对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），表明造模成功，见表 1。与模型组比较，白疕合剂高、中、低剂量组均能明显诱导T淋巴细胞增凋亡，抑制KC细胞增殖核抗原PCNA。SABC免疫组化法观察对照组小鼠PCNA表达阳性率和着色深度，着色浅，层次清楚；模型组小鼠着色深；中药高剂量、中剂量、低剂量组较模型组均着色深，以高剂量组最为明显；消银颗粒组着色较深，层次较清楚。PCNA蛋白表达检测结果见图2。

表1 白疕合剂对小鼠阴道组织中PCNA的表达 (±s，n=8)

表1 白疕合剂对小鼠阴道组织中PCNA的表达 (±s，n=8)

注：与空白对照组比较，△P<0.01；与模型组比较，*P<0.01；与消银颗粒组比较，#P<0.01，##P<0.05。

组别 药量（g/kg） 平均灰度值空白对照组 - 179.61±11.62*#模型组 - 97.55±4.36△#白疕高剂量组 11.5 141.10±3.42△*#白疕中剂量组 23.0 139.34±1.81△*##白疕低剂量组 46.0 116.69±2.25△*消银颗粒组 20.0 118.52±1.66△*

图2 白疕合剂及消银颗粒对小鼠阴道组织中PCNA蛋白表达（D A B显色×400倍）

3 讨论

银屑病是一种常见的慢性复发性红斑鳞屑性皮肤病，其病理生理特点包括KC过度增殖和分化不全两方面。雌激素周期的小鼠阴道上皮增生活跃，有丝分裂增多，细胞转化加快，模拟了银屑病表皮增生过快的特点[2]。近年来研究发现其临床表现与KC细胞及T淋巴细胞相关。

银屑病的发病机制还不十分清楚，现认为T细胞在银屑病发病中的重要作用，银屑病发病原因在于T淋巴细胞的异常，T细胞的活化是银屑病发病机制中的关键一步，其在进入皮损前已经活化，活化T细胞释放炎症性细胞因子,诱导角化细胞增殖，所以专家认为T细胞是银屑病表皮过度增殖的介质[3-4]。本实验结果显示，银屑病小鼠T淋巴细胞均有不同程度下降，与阴性对照组比较，白疕合剂各剂量组均能诱导小鼠T淋巴细胞的凋亡，各组差异不明显。

PCNA与细胞增殖的关系已经得到公认,但对银屑病与PCNA的关系研究甚少[5]。雌激素化的小鼠阴道上皮细胞处于增殖状态,用PCNA标记可从分子水平反映其增殖程度的变化,作为药效学研究指标更直观可靠。实验证明雌激素化的小鼠阴道上皮PCNA活跃表达,经白疕合剂各剂量组治疗后,PCNA表达明显受到抑制,白疕合剂对小鼠阴道上皮细胞PCNA表达影响的趋势与白疕合剂对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂影响的趋势有一致性，即有丝分裂指数以及PCNA阳性细胞数与药物浓度呈负相关,说明中药白疕合剂对小鼠阴道上皮细胞的增殖抑制作用疗效确切[6]。

以上研究提示，白疕合剂对T形成细胞凋亡的诱导作用及对小鼠阴道上皮PCNA表达的抑制作用可能是白疕合剂治疗银屑病的作用机制之一。

［1］李忻红，卢益萍.白疕合剂治疗寻常性银屑病临床观察[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2011，10（1）：40－41.

［2］卢传坚，吴晓霞，刘凤年.银屑灵对PCNA表达和角质形成细胞凋亡的影响[J].中药新药与临床药理，2006，17（5）：330－331.

［3］赵艳霞.T淋巴细胞与银屑病发病机制的关系[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2010，9（6）：398.

［4］艾克拜尔·安扎尔，热孜万·乌买尔.银屑病的T淋巴细胞介导免疫机制进展[J].内蒙古中医药，2010，1（2）：85.

［5］冯捷，苏宝山，郑玉萍，等.银屑病表皮中增殖细胞抗原与转化生长因子的表达水平[J].西安医科大学学报，1996，17（2）：218.

［6］刘拥军.银消丸对小鼠阴道上皮增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响[J].中国中医药科技，2007，14（6）：471.