刘红云，刘丽君，覃彩芹，田思思，李志萍

（1.湖北工程学院 生物质资源化学与环境生物技术湖北省重点实验室，湖北 孝感432000；2.湖北工程学院 生命科学技术学院，湖北 孝感432000）

酒精性肝细胞线粒体损伤和脂质过氧化在酒精性肝损伤发病机制中占有重要地位。线粒体机能障碍，尤其是线粒体解偶联，引起线粒体原动力降低，ATP损耗。损害的线粒体影响脂质动态平衡，生物能运行障碍，产生过多的活性氧，导致脂质积聚和氧化应激。线粒体机能障碍和／或解偶联，通过线粒体膜的透化作用、ATP损耗、坏死、凋亡容易造成肝细胞死亡。防止线粒体损伤将是酒精肝等疾病有效的治疗方法之一［1］。酒精可增强脂质过氧化和氧自由基的形成，导致氧化应激提升。Chari等发现酒精性肝硬化病人SOD、MDA等过氧化相关物质有显著变化，而非酒精性肝硬化病人无明显变化［2］。本研究探讨急性酒精性肝线粒体损伤和肝过氧化相关物质SOD、MDA的变化。

1 材料与方法

1.1 试剂

475mL／L酒精，1%詹纳斯绿B染液，0.25 mol／L缓冲蔗糖溶液，0.34mol／L缓冲蔗糖溶液，10%三氯乙酸，0.67%硫代巴比妥酸，13mol／L蛋氨酸溶液，63μmol／L氮蓝四唑溶液，40μmol／L核黄素溶液。以上试剂由湖北工程学院生科院实验中心药库提供的相关药品配制而成。

1.2 仪器设备

800型低速离心机，龙冈医疗机械厂制造；TGL－20M高速台式冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司制造；显微镜用测微尺，上海第三光学仪器厂制造；722E型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司制造。

1.3 动物分组建模

20只雄性昆明小白鼠，体重34～46g，由湖北职业技术学院医学实验动物中心提供，随机分为对照组10只，实验组10只。实验组按体重10 g／kg 475mL／L酒精一次性灌胃，对照组灌胃生理盐水。灌胃后48h取肝作相关检测。

1.4 线粒体分离

按肝细胞匀浆制备方法制备1g小鼠肝组织匀浆，差速离心，取纯化的线粒体沉淀物涂片，1%詹纳斯绿B染色，盖片后油镜下取2个视野取线粒体的最长和最宽处观察测量线粒体长和宽，求平均值。

1.5 MDA、SOD检测

MDA检测：每只小鼠取肝组织0.3g匀浆、离心、沸水浴、再离心，取上清分别在450nm、532nm、600nm下比色，计算MDA含量。

SOD检测：每只小鼠取肝组织0.3g冰浴匀浆、低温离心，取上清加样，光照培养显色，在550nm波长下测吸光度，计算SOD活性单位。

1.6 统计分析

各项检测数据用SPSS16.0进行t检验，求P值，判断差异显著性。

2 结果与分析

2.1 线粒体分离结果

对照组肝线粒体平均长是3.31μm，实验组是4.63μm，两者差异极显著（P＜0.01）。对照组肝线粒体平均宽是0.72μm，实验组是0.92μm，两者差异极显著（P＜0.01）。实验组肝线粒体变性，可见明显的肿胀和断裂，见图1。

图1 实验组小鼠肝线粒体肿胀和断裂（詹纳斯绿B染色，数显光镜，×5500）

2.2 MDA、SOD检测结果

MDA检测结果：对照组平均肝MDA是0.74μmol／g，实验组是1.63μmol／g，两者差异极显著（P ＜0.01）。

SOD检测结果：对照组平均肝SOD是8.37U／g，实验组是3.70U／g，两者差异极显著（P＜0.01）。

3 讨论

氧化应激与酒精性肝病等多种肝病及其发病机制有关。急慢性酒精中毒者，NADH产生过多触发了线粒体呼吸链酶Ⅰ、Ⅲ，氧自由基、过氧、活性氧产生增多可能是线粒体和细胞氧化应激及其损伤的主要原因。线粒体氧化应激容易使乙醇或乙醛介导的线粒体膜渗透性改变和细胞凋亡。急慢性酒精中毒和胆汁性肝硬化线粒体氧化应激先于肝细胞凋亡［3］。在培养的肝细胞里，氧化应激产生于乙醇代谢导致的线粒体膜除极和渗透性变化期间。线粒体的这些改变是细胞凋亡的关键一步。线粒体渗透性改变导致细胞色素C释放和半胱天冬酶激活。急慢性饮酒下调细胞内尤其是线粒体内抗氧化水平，易发细胞凋亡［4］。线粒体是细胞内有磷脂双层膜结构的细胞器，线粒体DNA和核DNA的缺失都能引发线粒体疾病［5］。自由基引发线粒体内脂质过氧化，不饱和脂肪酸破坏，MDA产生增多，导致线粒体膜流动性下降，通透性增加［6］。本研究显示线粒体有明显的肿胀和断裂可能与线粒体氧化应激、线粒体膜通透性改变有关。

酒精对白细胞介素－6（IL－6）缺陷小鼠有很强的引导MDA产生的作用。IL－6可用于防治酒精导致的肝细胞活性氧及MDA的产生、线粒体渗透性改变、ATP的损耗［7］。Uzun等用酒精、葡萄糖、精氨酸甲脂分别灌胃大鼠4周后酒精组MDA较葡萄糖组、精氨酸甲脂组极显著增高，SOD极显著降低［8］。我们对急性酒精性肝损伤抗氧化物质SOD、MDA的研究与相关文献报道基本一致。Saravanan等在对照组用酒精处理大鼠60天后，血清肝标志酶ALT、GGT、AST、ALP等升高，抗氧化物质SOD、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）降低，而实验组最后30天加用天仙子提取物处理大鼠后，肝标志酶显著降低，SOD、CAT、GPX等显著升高。天仙子提取物对酒精性肝损伤自由基介导的氧化应激有保护作用［9］。抗氧化、抗氧化应激也是急慢性酒精性肝损伤有效治疗的一个方面。

［1］Serviddio G，Bellanti F，Sastre J，et al.Targeting Mitochondria：A New Promising Approach for the Treatment of Liver Diseases［J］.Current Medicinal Chemistry，2010，17（22）：2325－2337.

［2］Chari S，Gupta M.Status of blood antioxidant enzymes in alcoholic cirrhosis［J］.Indian J Physiol Pharmacol，2003，47（3）：343－346.

［3］Sastre J，Serviddio G，Pereda J，et al.Mitochondrial function in liver disease［J］.Frontiers Bioscience，2007，12：1200－1209.

［4］Adachi M，Ishii H.Role of mitochondria in alcoholic liver injury［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，2002，32（6）：487－491.

［5］Huang C C，Hsu C H.Mitochondrial disease and mitochondrial DNA depletion syndromes［J］.Acta Neurol Taiwan，2009，18（4）：287－295.

［6］Deaciuc IV IV，D’Souza N B，Fortunato F，et al.Alcohol－induced sinusoidal endothelial cell dysfunction in the mouse is associated with exacerbated liver apoptosis and can be reversed by caspase inhibition［J］.Hepatology Research，2001，19（1）：85－97.

［7］El－Assal O，Hong F，Kim W H，et al.IL－6－deficient mice are susceptible to ethanol－induced hepatic steatosis：IL－6protects against ethanol－induced oxidative stress and mitochondrial permeability transition in the liver［J］.Cellular ＆ Molecular Immunology，2004，1（3）：205－211.

［8］Uzun H，Simsek G，Aydin S，et al.Potential effects of L－NAME on alcohol－induced oxidative stress［J］.World Journal of Gastroenterology，2005，11（4）：600－604.

［9］Saravanan N，Nalini N.Antioxidant effect of Hemidesmus indicus on ethanol－induced hepatotoxicity in rats［J］.Journal of Medicinal Food，2007，10（4）：675－682.