张睿 ，苏文莉 ，孙走南 ，杨益 ，刘京梅 ，何湘

1.辽宁省肿瘤医院，辽宁 沈阳 110042；2.军事医学科学院 疾病预防控制所，北京 100071

大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年增加的趋势。研究大肠癌的发生机制，有助于肿瘤的早期诊断、治疗。我们在前期工作中发现，与癌旁组织相比，结肠癌患者组织标本中caspase 8/10相关RING结构域蛋白1（caspase-8/10-associated RING domain protein1，CARP1）基因表达量显著增高。因此，为了更进一步研究CARP1在不同信号通路的功能，我们克隆了CARP1的全长基因，并构建了其真核表达载体，在293T细胞中进行了瞬时转染，发现表达的CARP1具有相应的生物学功能，为下一步研究奠定了工作基础。

1 材料和方法

1.1 材料

293T细胞、HCT116细胞、大肠杆菌DH5α、真核表达载体pcDNA3-Flag、受体相互作用蛋白1（recep⁃tor-interacting protein 1，RIP1）表 达 质 粒 Flag-RIP1、泛素表达质粒HA-Ubi由本实验室保存；限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ和cDNA合成试剂盒购自TaKaRa公司；T4DNA快速连接酶购自全氏金公司；蛋白酶体抑制剂MG132购自Sigma公司；萤光素酶活性测定试剂盒购自Promega公司；转染试剂Vigo⁃fect购自威格拉斯公司；DMEM培养基购自GIBCO生物公司；胎牛血清为杭州四季青公司产品；Flag抗体购自Sigma公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG购自中杉金桥生物有限公司；胶内DNA回收试剂盒、大量质粒提取试剂盒、TRIzol试剂和Pfu DNA聚合酶Mix购自北京天根生化科技有限公司；引物合成和测序由奥科公司完成。

1.2 从结肠癌细胞中扩增CARP1基因

参考TRIzol使用说明，从HCT116细胞中提取总RNA。根据CARP1的基因序列（GenBank登录号：NM_025126.2）和pcDNA3-Flag载体的多克隆位点，选择BamHⅠ和XhoⅠ作为酶切位点，设计上游引物5'-CGGGATCCatgaaggcgggtgccacgtctatg-3'（划线部分为BamHⅠ位点）、下游引物5'-CCGCTCGAGtcag⁃gacttgaacacgtg-3'（划线部分为XhoⅠ位点），以反转录的cDNA为模板，PCR扩增CARP1基因片段。反应条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃90 s，30个循环；72℃ 5 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，确定分子量正确后，回收目的基因。

1.3 CARP1基因真核表达载体的构建与鉴定

将回收的扩增产物和pcDNA3-Flag质粒分别用BamHⅠ/XhoⅠ双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳后回收。将双酶切的目的基因与pcDNA3-Flag载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，氨苄西林平板培养过夜。挑选候选阳性克隆进行菌落PCR鉴定，提取阳性克隆质粒进行双酶切鉴定，鉴定后的克隆送奥科公司测序。Myc-CARP1构建采用亚克隆方法，构建至Myc-tag3B载体。

1.4 细胞培养、转染及免疫印迹分析

HCT116细胞、293T细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基于CO2细胞培养箱中常规培养。转染按说明书进行，转染前24 h将293T细胞接种于6 cm细胞培养板中。将质粒与200 μL生理盐水混合，再将2 μL Vigofect与200 μL生理盐水混合，静置混匀后将两者轻轻混合，室温放置15 min，加入培养板中，继续培养24 h后，用1×PBS洗细胞3次，用裂解液裂解后，加入SDS上样缓冲液［50 mmol/L Tris-HCl（pH6.8），2%SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油，2.5% β-巯基乙醇］，沸水浴5 min，离心后取上清进行SDS-PAGE，电泳结束后转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温孵育1 h，然后加入稀释的Flag特异抗体4℃孵育过夜。用TBST洗膜3次，加入稀释的HRP偶联的羊抗鼠IgG，室温孵育1 h，用TBST洗膜3次，暗室中显影。

1.5 免疫共沉淀分析

质粒Flag-RIP1、HA-Ubi与Myc-CARP1共转染293细胞，以仅转染Flag-RIP1、仅转染Flag-RIP1和HA-Ubi为对照。按上述方法收取细胞，用含2%SDS的细胞裂解液［2%SDS，150 mmol/L NaCl，10 mmol/LTris-HCl（pH8.0），2mmol/LNa3VO4，50 mmol/L NaF，1×蛋白酶体抑制剂］裂解细胞，沸水浴10 min，离心后取上清，加入10倍体积的稀释缓冲液［10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），150 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA，1%Triton X-100］，样品混匀后加入20 μL抗Flag抗体琼脂糖珠（Sigma公司）进行免疫共沉淀实验，在4℃冰箱中旋转孵育2 h，孵育结束后3000 r/min离心1 min，弃上清，沉淀用洗涤缓冲液［10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1%NP-40］800 μL重悬，重复3次，最后一次离心沉淀的珠子中加入1×SDS上样缓冲液，沸水浴5 min，利用免疫印迹对蛋白的泛素化进行检测。

1.6 萤光素酶活性检测

按照试剂盒说明书进行。细胞接种于24孔板中 ，将 质 粒 pcDNA3-Flag-CARP1（0.1 μg/孔）、NF-κB-luc（0.1 μg/孔）、pRL（0.002 μg/孔）共同转染293T细胞，18 h后加入10 ng/μL TNFα处理6 h，用PBS洗2次，在每孔中加入100 μL裂解缓冲液，室温轻摇15 min，取50 μL测定萤光素酶活性。

2 结果

2.1 人结肠癌细胞系HCT116总RNA的提取

用TRIzol法提取HCT116细胞系总RNA，从图1中可以看到提取的总RNA有清晰的5S、18S、28S条带。

2.2 CARP1基因的扩增

以HCT116细胞系的cDNA为模板扩增CARP1基因，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在1000 bp左右出现明显的扩增条带（图2），与预期的CARP1基因长度一致。

2.3 重组pcDNA3-Flag-CARP1质粒的构建与鉴定

将双酶切的pcDNA3-Flag和目的片段CARP1连接，转入大肠杆菌，克隆长出后，用含氨苄西林的LB培养基进行菌液扩增，并用PCR检测是否含有CARP1片段。从图3A中可以看到1、2克隆中有CARP1插入片段；取1号克隆菌液提取质粒，经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后在1000 bp左右出现预期条带（图3B）。将1号克隆测序，比对发现CARP1测定序列与报道一致。

2.4 pcDNA3-Flag-CARP1在293T细胞中的表达

pcDNA3-Flag空载体和pcDNA3-Flag-CARP1质粒分别转染293T细胞，培养24 h后收集细胞，用裂解液裂解后经SDS-PAGE分离，Western印迹结果（图4）显示，与空载体对照相比，转染pcDNA3-Flag-CARP1的细胞中在相对分子质量30×103～55×103之间有一条特异性条带，与预期大小37×103相符，表明pcDNA3-Flag-CARP1在293T细胞中获得了表达。

图1 HCT116细胞总RNA的鉴定

图2 PCR扩增CARP1基因

图3 重组质粒的PCR（A）及酶切鉴定（B）

2.5 CARP1对RIP1泛素化及NF-κB转录活性的影响

从免疫共沉淀结果（图5A）可以看到，如果不加入CARP1，RIP1可见较弱的泛素化，而加入CARP1后RIP1泛素化明显增强。有文献报道，CARP1可以通过泛素化RIP1抑制TNFα激活NF-κB的功能。将pcDNA3-Flag空质粒或pcDNA3-Flag-CARP1和NF-κB-luc及pRL质粒共同转染细胞，4 h后换液，收细胞前6 h加入10 ng/mL TNFα刺激。从图5B可以看到，加入TNFα后，NF-κB活性增加了6倍，转染pcDNA3-Flag-CARP1后，TNFα引起的NF-κB升高的活性被明显抑制。这些结果提示我们，构建的pcDNA3-Flag-CARP1具有生物学活性。

图4 Western印迹鉴定CARP1在293T细胞中的表达

图5 CARP1活性检测

2.6 CARP1对结肠癌细胞系生长的影响

将pcDNA3-Flag空质粒或pcDNA3-Flag-CARP1分别转染相同数量的HCT116细胞，在24、48、72、96 h收取细胞计数并做图（图6），可以看到CARP1基因促进HCT116细胞的生长（P＜0.05）。顺铂（cisplatin，CDDP）是化疗常用药物，可以抑制肿瘤细胞的生长。从图6我们可以看到，在细胞中加入CDDP（5 μg/mL），HCT116 细胞的生长受到了明显抑制；而细胞中过表达CARP1时，CDDP的生长抑制作用减弱（P＜0.01）。进一步说明CARP1促进细胞生长，并可以部分抵抗化疗药物引起的细胞生长抑制作用。

图6 CARP1基因对细胞生长的影响

3 讨论

2004年El-Deiry等报道，CARP1可以泛素化caspase-8和-10，引起这2个蛋白通过蛋白酶体降解，从而抑制caspase-8和-10介导的凋亡[1]。CARP1含有一个RING锌指结构域，是泛素连接酶常见的结构域。CARP1的RING锌指结构域与牛小肠碱性磷酸酶（cIAP）结构域的同源性很高，而cIAP不具备降解caspase-8和-10的活性。文献还报道了CARP1可以泛素化从而降解抑癌基因p53，并降低p53ser20磷酸化水平[2-4]。另外，CARP1还参与到肿瘤坏死因子受体（TNFR）复合物中，通过蛋白酶体途径降解泛素化的RIP1，从而降低NF-κB的活性[5]。为了研究该基因的功能，我们从HCT116细胞cDNA文库中克隆了CARP1基因，构建了其真核表达载体pcDNA3-Flag-CARP1，瞬时转染293T细胞，利用Western印迹证实该表达载体能够在293T细胞中表达，最后利用体内泛素化实验及萤光素酶报告基因实验检测到构建的CARP1具有相应的生物学功能。另外，实验中还发现在HCT116中过表达CARP1可以促进HCT116细胞的增殖，并可部分抵抗顺铂引起的生长抑制，但机制并不清楚。以上结果说明CARP1可能参与肿瘤的发生、发展及耐药性的产生，为我们进一步研究CARP1的功能奠定了基础。

[1]McDonald E R,El-Deiry W S.Suppression of caspase-8-and-10-associated RING proteins results in sensitization to death ligandsand inhibition oftumorcellgrowth[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101:6170-6175.

[2]Yang W,Rozan L M,McDonaldⅢE R,et al.CARPs are ubiquitin ligasesthatpromoteMDM2-independentp53 and phospho-p53ser20degradation[J].J Biol Chem,2007,282:3273-3281.

[3]Yang W,Dicker D T,Chen J,et al.CARPs enhance p53 turnover by degrading 14-3-3sigma and stabilizing MDM2[J].Cell Cycle,2008,7(5):670-682.

[4]Yang W,El-Deiry W S.CARPs are E3 ligases that target apicalcaspases and p53[J].CancerBiolTher,2007,6(11):1676-1683.

[5]Liao W,Fujita K I,Xiao Q,et al.CARP1 regulates induc⁃tion of NF-κB by TNFα[J].Curr Biol,2009,19(1):R17-R18.

[6]Liao W,Xiao Q,Tchikov V,et al.CARP-2 is an endo⁃some-associated ubiquitin ligase for RIP and regulates TNF-induced NF-κB activation[J].Curr Biol,2008,18(9):641-649.