张康 ，梅倩 ，李祥 ，赵亚力 ，韩为东 ，孟元光

解放军总医院 a.妇产科；b.基础医学所分子生物室；北京 100853

微小RNA（microRNA，miRNA）是近年研究较为广泛的一类小分子非编码调控的内源性单链RNA，由19～25个核苷酸组成，通过与mRNA的3'非翻译区结合，降解mRNA或抑制其翻译，使基因在转录后水平产生沉默，调控基因表达[1]。目前，人类基因组中已确认数以千计的miRNA，可能参与人类30%的蛋白质的表达调控，对细胞周期调节、细胞生长、发育、凋亡、代谢、应激反应及肿瘤发生发展等过程都有重要的作用[2-5]。随着越来越多新的miRNA及其功能的不断发现，miRNA作为生物体重要的基因调控分子，与疾病的关系尤其是与肿瘤的关系成为生物医学领域研究的热点。

目前，研究miRNA功能多采用人工合成miRNA拟似物或拮抗物，但其作用时间短，难以适应肿瘤等渐进性疾病的研究。作为真核生物细胞基因转移的载体系统之一，人类免疫缺陷病毒1（HIV-1）来源的慢病毒载体越来越受到重视[6]。本研究旨在针对miRNA-455（miR-455）开展慢病毒质粒载体的构建研究，以探讨miR-455在宫颈癌中的作用机制和利用慢病毒进行基因治疗的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌细胞株SiHa、病毒包装细胞293T（本实验室保存，为贴壁细胞）；大肠杆菌TOP10（天根生化公司）；MEM培养基、胎牛血清（Gibco公司）；慢病毒表达载体pWPT-GFP、辅助包装原件载体pMD2G和 pSPAX2（本实验室保存）（图 1）；TRIzol试剂、Li⁃pofetAMINE2000（Invitrogen公 司）；SYBR Realtime PCR Master Mix（TOYOBO公司）；限制性核酸内切酶BamHⅠ、MluⅠ及T4DNA连接酶（NEB公司）；D2000 DNA marker（大连宝生物工程公司）；小量质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒（SBS公司）；质粒大提试剂盒（QIAGEN公司）。

1.2 PCR扩增pri-miR-455

通过EMBL数据库获得has-miR-455初始形式（pri-miR-455）的序列，应用Primer 5.0软件设计引物并由Invitrogen公司合成（引物F：5'CGGGATCCT GGCACAATGTTGGCAC3'；引 物 R：5'CGACGCGTG AAGCAAACTTACTCGT3'，上下游引物分别含有BamHⅠ和MluⅠ酶切位点）；以正常人基因组DNA为模板扩增，反应程序：94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环，每管 20 μL体系；纯化并回收PCR产物。

1.3 miR-455慢病毒质粒的构建

图1 pWPT-GFP质粒图谱

PCR扩增pri-miR-455，载体质粒为pWPTGFP，酶切位点为BamHⅠ和MluⅠ，酶切4 h使其线性化后，以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定比例，确定连接比例，进行连接。酶切回收载体DNA（100 ng/μL）1 μL，退火双链 DNA（100 ng/μL）6 μL，10×T4噬菌体DNA 连接酶缓冲 液 2 μL，T4DNA 连 接 酶 1 μL，ddH2O 10 μL，16℃连接过夜，转化细菌。阳性克隆PCR鉴定：上、下游引物各0.5 μL，2×Tap PCR Mas⁃ter Mix 10 μL，菌落裂解液 1 μL（阳性对照组不加，阴性对照组加水），由ddH2O配置反应体系为20 μL。PCR反应条件：94℃热启动30 s；94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸30 s,30个循环，72℃聚合6 min。分别挑选3个序列的阳性克隆送华大基因公司测序鉴定。

1.4 质粒抽提

用QIAGEN公司试剂盒抽提3种质粒，参照试剂盒说明书进行。

1.5 慢病毒重组体的包装、感染

胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以5×105接种于细胞培养皿中，于37℃、5%CO2培养箱内培养，细胞密度达70%～80%时进行转染。测序鉴定正确的重组质粒pWPT-GFP-pri-miR-455及2种辅助包装原件载体质粒 pSPAX2、pMD2G，按照 4∶2∶1的比例混合，用LipofetAMINE2000共转染到293T细胞，转染5 h后更换正常培养基继续培养，48、72 h后分别收集培养上清，感染未转染的SiHa细胞。

1.6 Real-time定量PCR检测慢病毒感染后miR-455的表达

小量包装获得的慢病毒转染宫颈癌SiHa细胞，感染3 d后在荧光显微镜下观察GFP的表达，若感染率低于50%则重新转染；若感染率超过50%，待感染5 d后，选择3～5个视野/孔，在荧光显微镜下观察发绿色荧光细胞的平均数与总细胞平均数的比值，估计质粒的转染效率。收集细胞，用Real-time定量PCR方法检测miR-455的表达，进而判断病毒的感染效率。PCR方法同上。定量数值采用2-ΔΔCt方法计算。每组重复3次实验。

1.7 统计学方法

所有实验结果用SPSS 13.0进行统计学分析，采用配对t检验，P＜0.05示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pri-miR-455的扩增

以基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到大小为550 bp的片段（图2），DNA测序证明扩增片段的核苷酸序列与GenBank中的pri-miR-455序列完全一致（序列未示）。

2.2 pWPT-GFP-pri-miR-455重组质粒的阳性克隆鉴定

pWPT-GFP-pri-miR-455重组质粒阳性克隆的PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳见图3，经测序，1～8号均正确。

2.3 质粒pWPT-GFP-pri-miR-455对293T细胞的转导效率

图2 pri-miR-455 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析

先鉴定构建的质粒对293T细胞的转染效率，转染效率在90%以上（图4A）；以2-ΔΔCt分析法计算，转染48 h后miR-455的表达量提高了37.1倍（图4B）。

2.4 慢病毒对SiHa细胞的感染效率

先鉴定构建的慢病毒上清对SiHa细胞的转导效率，感染效率在90%以上（图5A）；以2-ΔΔCt分析法计算，病毒感染后miR-455的表达量上调近40倍（图5B）。

3 讨论

miRNA作为一类具有基因表达调节作用的小分子，参与各种生物体的生理和病理功能[7]，约30%的蛋白编码基因受其调控[8]，其功能研究是近年来人们一直关注的话题。

图3 载体pWPT-GFP-pri-miR-455的测序结果

图4 质粒pWPT-GFP-pri-miR-455对293T细胞的转染效率

图5 慢病毒上清对SiHa细胞的感染效率

目前研究miRNA功能及机制的方法较多，但大致分为过表达或抑制表达两种方式。过表达研究又常选用瞬时转染或构建表达载体方法。瞬时转染可将人工合成的miRNA或其靶基因拟似物（mimics）[9]这些短序列，通过转染方式使其在体内发挥作用。此类方法实施起来方便快捷，但所建立的miRNA功能获得或缺失的动物模型无法适应长期研究，更无法进行传代。通过慢病毒包装技术可解决这一问题，尤其是miRNA在肿瘤发生发展中的作用等研究中，模式动物的建立将会发挥更大作用。

慢病毒载体是以HIV-1为基础发展起来的新兴载体，可以高效感染分裂期及非分裂期细胞，具有方法简单、目的基因整合率高并长期表达、免疫原性低等优点。此外，慢病毒为“自杀”性病毒，感染目的细胞后不会再感染其他细胞及产生新的病毒颗粒，安全性高，因而是一种强有力的基因运输工具，已成为当前基因治疗中载体研究的热点。

我们采用分子克隆技术构建了miR-455慢病毒表达载体，并建立了基于SiHa细胞的高效转染系统，为进一步鉴定miR-455在宫颈癌中的作用靶点及对其进行功能研究提供了有力支持。

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