查玉华，陈文霞，张鹏

军事医学科学院 附属医院，北京 100071

白细胞的迁移是炎症发生过程中必不可少的步骤之一。在炎症中，白细胞通过血管壁渗出到血管外并在炎症部位聚集，称为白细胞浸润。单核/巨噬细胞是浸润的主要白细胞之一[1]。浸润到组织间隙的单核/巨噬细胞能够发挥其吞噬功能，杀灭侵入的病原体，修复创伤组织；但同时也释放大量炎症因子、自由基及溶酶体酶，导致机体代谢紊乱和组织细胞损伤[2]。因此，揭示巨噬细胞迁移的调控机制十分重要。

在细胞迁移过程中，磷脂酰肌醇激酶（phospha⁃tidylinositol-3-OH kinase，PI3K）的激活起关键作用。PI3K的激活导致细胞内磷脂酰肌醇三磷酸［phosphatidylinositol-3，4，5-triphosphate，PI（3，4，5）P3］的产生，而 PI（3，4，5）P3则是细胞极化迁移过程中的枢纽物质[3-4]。PI（3，4，5）P3 可募集包含 Pleck⁃strin Homolgy（PH）结构域的细胞骨架调控蛋白，启动细胞骨架重组，细胞产生极化进而发生迁移[5]。PLEKHA1（PH domain-containing family A mem⁃ber 1）是包含PH结构域蛋白超家族的一员，生物信息学分析表明其可能与PI（3，4，5）P3相结合[6]，但其对细胞迁移的调控作用未见报道。本研究旨在探讨过表达PLEKHA1对巨噬细胞迁移的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

293FT和RAW264.7细胞，质粒pCMV-Myc-PLEKHA1为本室保存；大肠杆菌DH5α感受态菌购自依科赛公司；携带加强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因的慢病毒载体pCDH、包装质粒pMD和SPA由军事医学科学院放射与辐射医学研究所蛋白质组与基因组学研究室惠赠；LipofectAMINE 2000购自Invit⁃rogen公司；T4DNA连接酶、dNTP、PrimerSTAR HS高保真酶、DNA marker DL2000及限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ购自大连宝生物公司；质粒提取试剂盒、逆转录试剂盒DNA胶回收纯化试剂盒购自Promega公司；PLEKHA1抗体购自Santa Cruz公司；Transwell chambers购自Corning公司；N-formyl-me⁃thionyl-leucyl-phenylalanine（fMLP，F3506）购自 Sig⁃ma-Aldrich公司。

1.2 重组慢病毒载体的构建

以pCMV-Myc-PLEKHA1为模板进行PCR，上下游引物分别为P1（5'-TACGAATTCACATGCCTT ATGTGGATCGACA-3'）和 P2（5'-CGCGGCCGCTTC ACACATCGCTGACTGGCAG-3'）（循 环 参 数 ：94℃30 s、68℃ 2 min，30个循环）。纯化后得到目的片段，经双酶切后重组入慢病毒载体pCDH，重组慢病毒载体经双酶切鉴定并测序。

1.3 慢病毒包装

293FT包装细胞（培养基为高糖DMEM添加10%胎牛血清，0.1 mmol/L NEAA，0.2 mol/L L-谷氨酰胺）培养至细胞对数生长期时接种，培养基中不加抗生素。以六孔板为例，总质粒转染量为6 μg，分别为 pMD 1 μg、SPA 2 μg、pCDH-PLEKHA1 3 μg。转染后第 2 d换液，每孔加2 mL，转染后48 h再补2 mL；转染后72 h收上清，用0.22 μm滤器过滤，-70℃保存或立刻使用。

1.4 RAW264.7细胞的感染及筛选

六孔板铺细胞，被感染细胞的密度以4 d后长满为宜，病毒上清与完全培养基1∶1使用。4～5 d可见部分细胞发绿色荧光，此时用嘌呤霉素5 μg/mL处理24 h，然后换为新鲜的完全培养基，以促进细胞生长。

1.5 Western印迹

细胞用TNE裂解液［50 mmol/L Tris（pH7.4），150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，1%NP-40，加蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Roche）］裂解，SDS-PAGE分离蛋白后电转移至NC膜，用脱脂牛奶封闭液封闭1 h；加入一抗，室温温育2 h或4℃温育过夜；用TBST洗膜3次，每次10 min；加入相应的二抗，室温温育1 h；用TBST洗膜3次，每次10 min；将ECL显色液加到膜上，用保鲜膜把膜包起来；暗室中X线胶片曝光，显影、定影，流水冲洗X线胶片，干燥保存。

1.6 Transwell细胞迁移实验

小室孔径8 μm，直径6.5 mm。将1×105细胞混悬于100 mL RPMI1640培养基中加入小室，下层培养孔加入1 nmol/L fMLP；24 h后用甲醇固定小室中细胞，再用结晶紫溶液（0.1%结晶紫，20%甲醇）染色10 min；将小室冲洗干净，用棉签擦掉小室内侧膜上的细胞；取下小室底膜，于载玻片上观察拍照，随机选取至少5个视野计数。

1.7 统计学处理

数据以 x±s表示，两组间比较用 t检验，P＜0.05判断为有统计学意义。

2 结果

2.1 重组慢病毒载体的酶切鉴定及测序结果

以pCMV-Myc-PLEKHA1质粒为模板，PCR扩增PLEKHA1基因的重组慢病毒表达质粒经EcoRⅠ、NotⅠ双酶切后可获得1200 bp的目的片段（图1）。测序结果表明目的片段与NCBI公布的序列一致（未示）。

2.2 Western印迹检测稳定表达PLEKHA1的RAW264.7细胞

RAW264.7细胞分别感染对照病毒和PLEKHA1表达病毒，经嘌呤霉素筛选，连续传代5次后收集细胞进行Western印迹，以内源抗体检测。与对照组细胞相比，稳定表达PLEKHA1的RAW264.7细胞的PLEKHA1蛋白表达水平提高近30倍（图2），说明稳定表达小鼠PLEKHA1的RAW264.7细胞系构建成功。

2.3 PLEKHA1抑制巨噬细胞迁移

图1 重组质粒的双酶切鉴定

稳定表达小鼠PLEKHA1的RAW264.7细胞系构建成功后，采用Transwell方法研究PLEKHA1对巨噬细胞迁移的影响。计数聚碳酸酯膜下表面的细胞数，结果见图3，PLEKHA1组穿过小室的细胞数明显低于对照组（46±7 vs 18±4，P＜0.05）。

图2 Western印迹检测PLEKHA1的表达

图3 细胞迁移实验

3 讨论

迁移是细胞最古老的行为之一。单细胞生物觅食，多细胞生物的发育、创伤愈合以及免疫反应无不需要细胞迁移的参与。巨噬细胞的迁移更是与免疫反应直接相关。巨噬细胞迁移异常，与动脉粥样硬化、肥胖的发生密切相关[7-8]。因此，发现新的巨噬细胞迁移调控因子，对于深化对巨噬细胞相关疾病发生发展的认识有重要作用。在本研究中，我们以小鼠RAW264.7巨噬细胞为研究对象，通过慢病毒介导的方法，获得稳定表达PH结构域蛋白PLEKHA1的细胞株，并检测了其迁移能力。结果显示巨噬细胞中过表达PLEKHA1能使其迁移能力减弱，提示PLEKHA1是一个新的巨噬细胞迁移调控因子。这一细胞株的建立，也为进一步研究PLEKHA1在巨噬细胞相关病理生理过程中的作用及机制提供了模型。

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