孙卫国，李邦印，刘艳华，张灵霞，熊志红，程小星

解放军第309医院 结核病研究所，北京 100091

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tu⁃berculosis，MTB）引起的慢性传染病，目前死亡率仍然比较高。人群中绝大多数MTB感染为潜伏感染，MTB处于休眠状态，在机体免疫力低下或伴随其他感染时，休眠的MTB受激活引发结核病。结核病人的继发感染成为结核病传播和再发的重大隐患[1]。快速灵敏的诊断技术和规范有效的治疗是控制结核病的关键[2]。结核病的临床诊断有诸多方法，而基于特异性抗原的结核病血清学诊断快速具有特异性高、敏感性强、重复稳定性好的特点，操作简便，可以肉眼判断结果，有望成为结核病临床诊断的首选方法。寻找一种高敏感性和高特异性的结核抗原成分，是利用血清学进行早期快速准确诊断的前提。结核分枝杆菌PPE蛋白家族是一类富含甘氨酸且为结核分枝杆菌特有的蛋白[3]，这类蛋白含有共同的Pro-Pro-Glu结构域，蛋白间没有共同的作用位点，相互间没有交叉反应[4]。Rv3425是PPE家族第3亚族的一个成员，由176个氨基酸残基组成，为免疫显性的B细胞目标抗原，为RD11区蛋白。生物信息学预测表明，Rv3425的19～176位残基覆盖了Rv3425全部的抗原指数较强的B细胞抗原决定簇[5]。

我们以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，常规PCR扩增Rv3425基因，获得原核表达的重组Rv3425蛋白，探讨了其免疫学活性及在检测血清中抗结核抗体方面的应用价值，为研制更有效的结核病免疫诊断试剂及新型治疗药物奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

临床诊断病人血清和健康人血清均由本所临床检验室提供；大肠杆菌BL21（DE3）、结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA、质粒pET-28a均系本室保存；内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶和dNTP均购自TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物工程公司合成；酶标羊抗人IgG（HRP）购自中山生物工程技术公司；亲和色谱填料购自Bio-rad公司；其他生化试剂均为国产分析纯。

1.2 引物设计

根据GenBank中的结核杆菌H37Rv株Rv3425基因序列（Gene ID：887635）设计合成特异性引物，在反向引物中将原有终止密码子改为大肠杆菌偏性的TAA。上下游引物分别为P1（5'-GGAATTC⁃CATATGCATCCAATGATACCAGCGGAG-3'）和 P2（5'-CCGCTCGAGTTACCCGCCCCTGTAGATC-3'），下划线序列分别为NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点。

1.3 pET-28a-Rv3425重组质粒的构建

以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用引物P1、P2通过PCR扩增Rv3425核酸序列并回收PCR产物。用NdeⅠ和XhoⅠ酶切PCR产物，然后在T4DNA连接酶的作用下，把回收片段克隆到经同样酶切的原核表达质粒pET-28a中，连接产物转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），筛选阳性克隆测序。

1.4 结核杆菌Rv3425蛋白的原核表达

将测序正确的工程菌接种含卡那霉素的LB培养基，37℃振摇培养至菌液D600nm达0.4时，立即加入IPTG至终浓度为0.6 mmol/L，37℃继续诱导7 h，离心收集菌体，按1∶10的比例将菌体溶于1×PBS缓冲液中，充分混匀，低温条件下超声波破碎，离心后收集上清和沉淀，进行14%的SDS-PAGE，分析目的蛋白的表达量和表达形式。

1.5 结核杆菌Rv3425蛋白的复性与纯化

Rv3425蛋白以包涵体的形式存在，将包涵体先后用1%的Triton X-100和3 mol/L盐酸胍交替洗涤，洗涤后的包涵体用含6 mol/L盐酸胍、10 mmol/L β-巯基乙醇的TE缓冲液变性溶解，高速离心取上清，上清液以1∶50的比例和5 mL/h的速度滴加到复 性 液（25 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L GSSG，0.2 mmol/L GSH，pH8.0）中，4℃放置过夜，高速离心除去沉淀，在4℃条件下取上清过镍离子亲和柱，分别以50、150 mmol/L的咪唑洗脱杂蛋白和目的融合蛋白，收集穿过峰和洗脱峰蛋白，进行14%的 SDS-PAGE，分析纯化的目的蛋白的纯度，对纯化的重组蛋白进行水透析后冻干保存。

1.6 结核杆菌Rv3425蛋白的免疫印迹分析

取纯化的Rv3425蛋白，经SDS-PAGE后采用半干法转到PVDF膜上，依次经5%脱脂奶粉封闭、3例临床确诊的结核病病人血清、HRP标记的羊抗人IgG孵育后，漂洗干净，加入化学发光试剂，在ECL暗室中自动曝光显影，初步分析Rv3425蛋白的抗原特异性。

1.7 结核杆菌Rv3425蛋白的人血清ELISA分析

用碳酸盐缓冲液将Rv3425蛋白稀释至1 μg/mL，酶标板每孔包被100 μL，室温2 h，洗板5次后用30%的BSA于37℃封闭2 h，洗板5次，瞬时倒扣滤纸吸干；待测血清用PBS缓冲液稀释至1/200，取100 μL加入反应孔，37℃温箱放置1 h，洗板5次；每孔加入用PBS稀释至1/1000的HRP标记的羊抗人IgG 100 μL，于37℃温箱放置1 h，洗板5次，加入TMB显色液，于37℃温箱中反应30 min显色，酶标仪检测D450nm值，大于1.0为阳性。

2 结果

2.1 原核表达载体pET-28a-Rv3425的构建

以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，通过常规PCR方法扩增得到成熟Rv3425核酸序列。经1%琼脂糖电泳，在约530 bp处获得单一的电泳条带（图1）。将PCR片段经酶切后克隆至表达载体pET-28a中，转化感受态大肠杆菌BL（DE3），筛选测序结果与预期完全一致的克隆。

2.2 结核杆菌Rv3425蛋白的原核表达

取测序正确的克隆菌落接种含卡那霉素的LB培养基，37℃培养至菌液D600nm为0.4时加入IPTG继续诱导7 h，菌体经超声破碎后进行SDS-PAGE，在相对分子质量20×103处有表达条带，与Rv3425分子大小一致，表达量占细菌总蛋白的20%～25%，基本以包涵体形式存在于超声波破碎后的细菌沉淀中（图2）。

2.3 结核杆菌Rv3425蛋白的纯化

图1 凝胶电泳鉴定PCR扩增的Rv3425基因

将包涵体初步提纯后，用6 mol/L盐酸胍和10 mmol/L β-巯基乙醇变性，在配制的复性液中进行滴加复性，低温过夜放置后高速离心除去沉淀。在4℃条件下取上清，用镍离子亲和柱纯化，分别以50、150 mmol/L的咪唑洗脱杂蛋白和目的蛋白，收集穿过峰和洗脱峰蛋白进行14%的SDS-PAGE，分析纯化的目的蛋白的纯度，结果如图3，纯化后Rv3425蛋白的纯度达90%以上，用水透析后冻干保存。

2.4 Western印迹鉴定Rv3425蛋白的抗原性

取纯化后的Rv3425蛋白，用PBS缓冲液配制成1 mg/mL的储存液，行14%的SDS-PAGE后转移至硝酸纤维素膜上，封闭后，分别与3例强阳性人血清和6例健康人血清孵育，与HRP标记的羊抗人二抗结合反应，ECL暗室中自动曝光显影，结果见图4。Rv3425蛋白能与3例阳性血清结合，而与6例健康人血清的反应不明显。Western印迹结果证实Rv3425具有较强的抗原性。

图2 pET-28a-Rv3425原核表达产物的SDS-PAGE分析

图3 SDS-PAGE分析亲和纯化的Rv3425蛋白

图4 Western印迹分析重组蛋白Rv3425的抗原性

2.5 ELISA分析

实验表明最佳重组抗原包被浓度为1 μg/mL，血清稀释度为1∶200。以复性纯化后的Rv3425蛋白抗原分别对60份阳性血清和40份阴性血清进行检测，其中阳性血清检出30例，检出率为50%；健康人血清检出2例，检出率为5%，特异度为95%。结核病人组的阳性率明显高于对照组健康人。ELISA结果说明，重组蛋白Rv3425可作为待选抗原，用于结核病人的血清学诊断。

3 讨论

目前临床采用的结核杆菌细菌学诊断方法检出率低、培养耗时长，很难满足检测需要。血清学检测具有简单、快速的特点，一直是临床结核分枝杆菌诊断研究的重点，但至今未找到理想的靶抗原[6]。Rv3425是由结核杆菌RD11区编码的PPE蛋白家族成员，仅存在于致病性结核分枝杆菌中，作为诊断抗原在结核病临床诊断方面有广阔的应用前景[7]。在本研究中，我们用大肠杆菌表达系统获得的重组Rv3425蛋白具有较强的抗原性，对60例阳性患者血清的总体检出率达到50%。使用单一抗原时阳性检出率往往都比较低，目前还没有一种结核抗原能够全部检测出阳性血清。研究发现，采用CFP10-ES⁃AT6-Rv3425融合抗原可以提高结核杆菌检出率，同时将多个单独监测抗原联合用于结核病的血清诊断可获得较高的阳性检出率[8]。综上，我们得到了高纯度重组Rv3425蛋白，为今后开发能区别结核感染状态的血清学鉴别诊断试剂，及针对结核分枝杆菌感染者的治疗性疫苗的候选抗原打下了基础。

[1]Voskuil M I,Schnappinger D,Visconti K C,et al.Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuber⁃culosis dormancy program[J].J Exp Med,2003,198(5):705-713.

[2]Bello A K,Njoku C H.Tuberculosis current trends in diagno⁃sis and treatment[J].Clin Pract,2005,8(2):118-124.

[3]Moigne V L,Robreau G,Borot C,et al.Expression,immuno⁃chemical characterization and localization of the Mycobacteri⁃um tuberculosis protein[J].Tuberculosis,2005,85(4):213-219.

[4]Choudhary R K,Mukhopadhyay S,Chakhaiyar P,et al.PPE antigen Rv2430c ofMycobacterium tuberculosis induces a strong B-cell response[J].Infect Immun,2003,71(8):6338-6343.

[5]吴静希,岳俊杰,姜永强,等.结核分枝杆菌Rv3425特异性蛋白片段与CFP10-ESAT6融合蛋白在结核抗体检测中的应用价值[J].生物技术通讯,2011,22(3):394-397.

[6]Araujo Z,Acosta M,Escobar H,et al.Immunitary response in tuberculosis and the role of Mycobacterium tuberculosis se⁃cretion antigens in its protection,pathology and diagnosis[J].Invest Clin,2008,49(3):411-441.

[7]Zhang H J,Wang J,Lei M,et al.PPE protein(Rv3425)from DNA segment DII of Mycobacterium tuberculosis:a potential B-cell antigen used for serological diagnosis to distingusish vaccinated controls from tuberculosis patients[J].Clin Microbi⁃ol Infect,2007,13:139-145.

[8]吴兴福,孙战强,徐明.结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425基因片段融合蛋白的表达与纯化[J].临床肺科杂志,2011,16(10):1533-1535.