邢玉华 ，戴素琴 ，刘体颜 ，王微 ，谭俊杰 ，曲国龙 ，刘刚 ，陈惠鹏

1.军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100071；2.吉林大学 生命科学学院，吉林 长春 130012；3.安徽大学 生命科学学院，安徽 合肥 230039

链霉菌属于放线菌，是革兰阳性菌，其基因组中GC含量很高（＞70%）。链霉菌能够产生多种活性物质，尤其是能够产生丰富的抗生素，目前75%的天然抗生素都来自链霉菌[1]。达托霉素（daptomycin）是一种新型环脂肽类抗生素，2003年9月经美国食品和药物管理局（FDA）批准在美国上市。达托霉素具有在体外抗绝大多数临床革兰阳性菌的作用，主要用于耐药菌的感染治疗[2]。达托霉素的生物合成经非核糖体肽合成酶（NRPS）途径，其合成基因成簇排列在染色体上，共同调控达托霉素的合成[3]。因此，对达托霉素合成基因的克隆与分析，对了解达托霉素的调控机制，提高达托霉素的产量有重要意义。

达托霉素的生物合成基因簇总长128 kb，其平均GC含量为71%，我们曾尝试用常规PCR方法分段扩增，但很难将其扩增出来。由于许多非编码区的序列是高度保守的，密码子优化的方法也受到限制。因此，我们选择10个1 kb的片段进行扩增，尝试通过对PCR反应条件进行优化，包括加入不同的PCR添加剂[4-8]及调整PCR循环程序[9-10]，从而实现对高GC含量的达托霉素生物合成基因的扩增，同时也实现了对长达6 kb的高GC含量DNA的扩增。

1 材料与方法

1.1 材料

玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus）31568菌株购自美国ATCC；大肠杆菌DH5α、DH10B化学感受态购自北京博迈德公司；pMD18-T载体和LA Taq聚合酶购自TaKaRa公司；Q5高保真DNA聚合酶、7-deaza-dGTP、dNTP、各种限制性内切酶均购自NEB公司；质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购自Axygen公司；DyNAzymeⅡDNA聚合酶购自Thermo公司；链霉菌基因组提取试剂盒购自GENMED公司；DMSO及其他化学试剂均购自Sigma公司。

1.2 引物设计

我们将达托霉素生物合成基因簇分成128个平均长度为1080 bp的片段，分别进行扩增，序列之间带有重叠序列，方便后续拼接。用Primer Premier 5.0软件设计引物，两端带有XbaⅠ和HindⅢ酶切位点，由北京奥科鼎盛公司合成，序列见表1。

1.3 模板的制备

用GENMED公司的链霉菌属基因组DNA提取试剂盒提取玫瑰孢链霉菌基因组DNA，DNA的浓度和质量经NanoDrop 2000分光光度计测定。

1.4 PCR扩增体系

LA Taq聚合酶反应体系（共50 μL）包括25 μL 2×GC缓冲液Ⅰ、400 μmol/L dNTP、引物各0.5 μmol/L、100 ng基因组DNA、2.5 U LA Taq聚合酶。

Q5高保真聚合酶反应体系（共50 μL）包括10 μL 5×Q5反应缓冲液、10 μL 5×Q5 High GC En⁃hancer、200 μmol/L dNTP、引 物 各 0.5 μmol/L、50 ng基因组DNA、1 U Q5聚合酶。反应体系中分别加入不同浓度的DMSO（1%～4%）、7-Deaza-dGTP∶dGTP（1∶1或 3∶1）。

1.5 PCR扩增程序

LA Taq聚合酶的扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，固定温度（55～68℃）退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min。

Q5聚合酶的扩增程序：98℃预变性30 s；98℃变性10 s，固定温度（55～68℃）退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸2 min。

Touch down PCR循环程序：98℃预变性30 s；98℃变性 10 s，71℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，退火温度每个循环降低0.2℃，30个循环；之后98℃变性10 s，65℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，15个循环；72℃延伸2 min。

1.6 PCR产物分析及测序

取 20 μL PCR 产物，加入 4 μL 6×上样缓冲液，行1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，用凝胶成像系统分析拍照，目的条带用凝胶回收试剂盒回收。Q5高保真聚合酶扩增的DNA需用DyNAzymeⅡDNA聚合酶加A处理，LA Taq聚合酶扩增的片段则直接与pMD18T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，次日挑克隆，酶切鉴定挑选阳性克隆测序（测序由北京奥科鼎盛公司进行），比对测序结果，进行保真度分析。

表1 引物及序列

2 结果

2.1 达托霉素生物合成基因簇DNA片段的LA PCR扩增

以玫瑰孢链霉菌基因组DNA为模板，用LA Taq DNA聚合酶使用GC缓冲液进行扩增，能扩增出2个片段（401和678），其他均没有目的条带。对401和678进行测序，发现有大量突变和错配。

2.2 达托霉素生物合成基因簇DNA片段PCR扩增条件的优化

鉴于后续的克隆表达，我们选用了高保真的Q5 DNA聚合酶进行扩增。首先摸索了不同退火温度对PCR扩增的影响，发现较高的温度能极大地提高扩增量和产物特异性（图1）。但单独提高退火温度对于某些DNA（如067和1245）的扩增是无效的，因此，针对这些片段还须进行其他条件优化。

有文献报道，在反应体系中加入增强剂可以提高反应的特异性和产量。常用的增强剂有甘油、DMSO、甲酰胺、7-deaza-dGTP和镁离子等，对减少高GC区域的二级结构等都有一定的功效。我们主要探讨了不同浓度的DMSO和7-deaza-dGTP对扩增效率的影响。由于我们使用的商品化聚合酶试剂盒中的GC增强剂成分不明，按照说明书尝试加入1%～4%的DMSO，结果表明DMSO能显著地提高1245的扩增量（图2），但多次结果也表明DMSO对扩增的特异性没有太大帮助，甚至有时会降低产物的特异性。同时，我们探讨了7-deaza-dGTP对扩增的影响。7-deaza-dGTP[11-12]是dGTP的类似物，能够减少二级结构形成。我们在反应体系中分别加入100 μmol/L 7-deaza-dGTP和100 μmol/L dGTP，及150 μmol/L 7-deaza-dGTP和50 μmol/L dGTP。对于片段067，在加入7-deaza-dGTP后，在较高的退火温度下能够看到有目的条带扩增出来，但仍然很弱（图3A）。因此，我们选用touch down PCR进行扩增，结果表明能将067扩增出来。用touch down PCR并同时添加7-deaza-dGTP进行扩增，发现目的条带的扩增量没有增加反而降低了，但产物特异性有很大提高（图3B）。测序表明加入7-deaza-dGTP后扩增的突变及错配碱基数减少，而且原本测序经常信号中断的克隆也大大得到改善（图4），可见7-deaza-dGTP能够提高产物的特异性及确保测序反应的顺利进行。

2.3 达托霉素生物合成基因簇DNA片段的PCR扩增

我们曾尝试将DMSO与7-deaza-dGTP组合添加到PCR反应体系中，结果发现扩增效果没有改变，说明DMSO与7-deaza-dGTP在这种体系中并不存在协同作用，或者可能会相互抑制，其原因目前还不清楚。因此，考虑到后续拼接、克隆及表达，我们选用touch down PCR及添加7-deaza-dGTP作为我们克隆达托霉素生物合成基因簇的常规方法。应用这种方法，我们将选择的10个DNA片段全部扩增出来，继而扩增了所有的达托霉素合成基因。电泳图中虽然还存在一些非特异性条带，但每个片段的扩增量均能达到克隆的要求，无须重新设计引物扩增。图5为PCR产物纯化后的电泳结果。

2.4 PCR扩增达托霉素生物合成基因簇长片段DNA

利用touch down PCR及添加7-deaza-dGTP的方法，我们还进一步对不同长度的达托霉素生物合成基因簇DNA片段进行了扩增，1～6 kb均有目的条带出现（图6）。为了验证长片段高GC含量DNA的PCR产物的保真度，连接到pMD18-T载体上进行测序，结果表明直到6 kb的序列全都正确，说明利用这种方法进行长片段高GC含量DNA的PCR扩增是可行的。利用以上条件我们尝试扩增更长的片段，结果7、8 kb片段的扩增没有成功，但也足以满足拼接所需。

图1 不同退火温度对高GC含量DNA PCR的影响

3 讨论

达托霉素的生物合成基因簇DNA平均GC含量很高，经常出现多个连续的G或C，而且还含有重复序列。笔者在前期用常规PCR方法很难（甚至不可能）扩增出基因。高GC含量DNA的PCR扩增的难点在于模板DNA形成的二级结构，使得DNA模板比较难变性，94℃下可能变性不完全；退火时引物与模板不能很好地结合，容易形成错配；延伸过程也不能很好地进行，从而使扩增效率大大降低。PCR添加剂降低熔解温度，有助于引物退火，并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。本研究结果表明DMSO和7-deaza-dGTP对于提高PCR扩增效率有很大帮助，而且采用touch down PCR的方法，先高温下退火再缓慢降温，能极大地提高PCR产物扩增的特异性。我们向反应体系中加入1%～4%的DMSO，对大多数的DNA片段均能提高其扩增产量，而且以4%的DMSO效果最佳。但同时我们还发现，虽然扩增量提高，但反应的特异性降低，出现了很多非特异性条带，可能是降低了熔解温度所致。我们继续加大DMSO的量，发现几乎扩增不出任何条带，经分析认为可能是DMSO抑制了聚合酶的活性。文献报道7-deaza-dGTP会增加PCR扩增的产量和特异性[13]，但我们的研究表明7-deaza-dGTP的加入不会增加产物的扩增量，反而会降低，原因还有待于考察。然而7-deaza-dGTP确实可以提高产物的特异性和保真度，而且使测序反应更容易进行。

图2 DMSO对PCR扩增高GC含量DNA模板（1245）的影响

图3 7-deaza-dGTP对PCR扩增高GC含量DNA模板（067）的影响

图4 片段1245测序的部分结果

图5 达托霉素生物合成基因簇部分片段的PCR扩增结果

图6 PCR扩增不同长度高GC含量DNA的结果

以上结果表明我们建立了采用touch down PCR并添加7-deaza-dGTP或DMSO进行高GC含量DNA扩增的程序。基于此方法，我们成功地将达托霉素的生物合成基因簇（128 kb）分段扩增出来，经内切酶消化后可用于后续拼接。此外，我们还尝试用该方法进行长片段DNA的扩增，实现了长达6 kb的高GC含量DNA的扩增，但对于更长片段的扩增（＞8 kb）没有成功，还须进一步摸索，比如探讨反应过程中添加聚合酶等方法。综上，我们建立了扩增长片段高GC含量DNA的方法，对研究达托霉素的作用机制以及提高其产量将有很大的帮助。

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