李 萍，曾常茜

（1.吉林省图们市人民医院内科，图们 133100；2：大连大学医学院，大连 116622）

透骨草（Phryma leptostachyaL.var.asiatica Hara）为透骨草科植物的干燥全草入药，具有清热解表、活血消肿作用[1]。文献报道，透骨草提取物对多种肿瘤细胞增殖有显著抑制作用[2]。本实验首次将透骨草提取物作用于人肝癌SMMC-7721细胞，观察透骨草提取物对SMMC-7721细胞凋亡及凋亡相关蛋白caspase-9、-3、-7和X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）蛋白表达的影响，探讨透骨草提取物诱导SMMC-7721细胞凋亡的分子机制，旨在为透骨草抗肝癌作用的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂及仪器 人肝癌SMMC-7721细胞由吉林省肿瘤研究所提供；鼠抗人caspase-9、-3、-7抗体购自Cell Signaling Technology公司，鼠抗人XIAP单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术公司。RPMI 1640、小牛血清和胰蛋白酶为美国Gibco公司产品；药物采自辽宁金州大黑山，经王心毓老先生鉴定为透骨草科植物（Phryma leptostachyaL.var.asiatica Hara）；流式细胞仪（FACSNANTATE-SETM）为美国BD公司产品。

1.2 方法

1.2.1 透骨草提取物制备方法 采取加热回流提取法，取干燥透骨草50 g，加8倍量75%乙醇，提取2 h，过滤，滤液水浴浓缩成干膏。

1.2.2 细胞培养 SMMC-7721细胞培养于10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，在37℃，5%二氧化碳（CO2）的条件下培养。胰酶消化传代，每2~3 d传代1次,实验选用对数生长期细胞。

1.2.3 实验分组 SMMC-7721细胞生长至对数生长期，实验组加入透骨草提取物溶液，终浓度为40.91 μg/mL，对照组加入 RPMI-1640培养液，继续培养24 h。

1.2.4 流式细胞术检测SMMC-7721细胞凋亡 分别收集经实验组和对照组的SMMC-7721细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，用预冷70%乙醇4℃固定24 h，PBS洗涤2次，制成1 mL细胞悬液，加入20 U/mL Rnase，37℃水浴1 h，再加入含碘化丙啶（100 μg/mL）染色，4 ℃避光染色 30 min，流式细胞仪检测。

1.2.5 免疫组化法检测SMMC-7721细胞Caspase-9、-3、-7和XIAP蛋白表达 按试剂盒说明进行操作。分别收集实验组和对照组的SMMC-7721细胞，制成细胞悬液涂片，丙酮固定。3%过氧化氢室温孵育15 min。正常山羊血清室温孵育15 min。分别与鼠抗人Caspase-9、-3、-7抗体、鼠抗人XIAP抗体37℃孵育2 h，PBS洗3次。与生物素标记二抗室温孵育 15 min，PBS洗3次。与ABC液室温孵育10 min，PBS洗3次。DAB溶液显色，蒸馏水冲洗、苏木素衬染、脱水、封片，显微镜下观察，细胞核或细胞浆出现棕色或棕褐色颗粒判断为阳性细胞，无棕色染色者为阴性细胞，计数200个细胞并计算阳性细胞占所有细胞的比例。

1.2.6 统计学处理 实验数据采用SPSS18.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较行单因方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 透骨草提取物对SMMC-7721细胞凋亡的影响 流式细胞术检测结果显示，未用透骨草提取物处理的对照组SMMC-7721细胞凋亡率为（3.76±1.01）%，而用 40.91 μg/mL透骨草提取物作用 24 h的SMMC-7721细胞凋亡率为（26.84±1.23）%，两组比较，差异有统计学意义（P<0.01），见表1。

表1 流式细胞术检测SMMC-7721细胞凋亡结果（±s，n＝3）Tab.1 Apoptosis rates of SMMC-7721 cells with flowcytometry（±s，n＝3）

注：与对照组比较，*P<0.05。

组别 凋亡率对照组 3.76±1.0140.91 μg/mL 透骨草提取物处理组 26.84±1.23*

2.2 透骨草提取物对SMMC-7721细胞Caspase-9、-3、-7和XIAP蛋白表达的影响 免疫组化方法观察结果显示，未用透骨草提取物处理的对照组SMMC-7721细胞Caspase-9蛋白高表达，细胞浆或细胞核着棕黄色的细胞量多，经40.91 μg/mL透骨草提取物处理后的SMMC-7721细胞Caspase-9蛋白表达明显降低，细胞浆或细胞核着棕黄色的细胞量少，经统计学处理差异显著（P＜0.05）；未用透骨草提取物处理的对照组SMMC-7721细胞Caspase-3蛋白高表达，细胞浆或细胞核着棕黄色的细胞量多，经40.91 μg/mL透骨草提取物处理后的SMMC-7721细胞Caspase-3蛋白表达明显降低，细胞浆或细胞核着棕黄色的细胞量少，经统计学处理差异显著（P＜0.05）；未用透骨草提取物处理的对照组SMMC-7721细胞Caspase-7蛋白高表达，细胞浆或细胞核着棕黄色的细胞量多，经40.91 μg/mL透骨草提取物处理后的SMMC-7721细胞Caspase-7蛋白表达明显降低，细胞浆或细胞核着棕黄色的细胞量少，经统计学处理差异有统计学意义（P＜0.05）；未用透骨草提取物处理的对照组SMMC-7721细胞XIAP蛋白低表达，细胞浆或细胞核着棕黄色的细胞量少，经40.91μg/mL透骨草提取物处理后的SMMC-7721细胞XIAP蛋白表达明显增加，细胞浆或细胞核着棕黄色的细胞量多，经统计学处理差异有统计学意义（P＜0.05），见表 2。

表2 SMMC-7721细胞Caspase-9、-3、-7和XIAP蛋白表达结果（±s，n＝3）Tab.2 The expression of protein of Caspase-9、-3、-7 and XIAP in SMMC-7721 cells（±s，n＝3）

表2 SMMC-7721细胞Caspase-9、-3、-7和XIAP蛋白表达结果（±s，n＝3）Tab.2 The expression of protein of Caspase-9、-3、-7 and XIAP in SMMC-7721 cells（±s，n＝3）

注：与对照组比较，*P<0.05。

组别 Caspae-9 Caspase-3 Caspae-7 XIAP对照组 51.2±1.9 59.8±2.2 42.6±1.5 11.4±1.040.91 μg/mL 透骨草提取物处理组 14.7±1.2*17.3±1.1*11.2±0.8*43.7±2.3

3 讨论

现代研究表明，中医药在防治肿瘤过程中扮演着不可替代的角色[3-4]。中药物抗肿瘤的活性与药物引起肿瘤细胞发生凋亡密切相关[5-7]。本实验将透骨草提取物作用于SMMC-7721细胞，结果表明SMMC-7721细胞凋亡率显著高于对照组，说明透骨草提取物可诱导SMMC-7721细胞凋亡。

Caspases是以天冬氨酸为底物的半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡调控过程中具有重要作用[8-9]。当细胞在损伤因素作用或接受凋亡信号时，促使细胞色素C从线粒体中释放出来并与凋亡酶激活因子-1结合，形成多聚体，并促使Caspase-9前体与其结合形成凋亡小体，导致Caspase-9被激活，激活的Caspase-9再激活Caspase-3、-7，导致细胞凋亡[10]。本研究结果表明40.91 μg/mL透骨草提取物处理SMMC-7721细胞 24 h后，Caspase-9、-3、-7蛋白表达水平与对照组相比显著下降，说明透骨草提取物可能通过激活Caspase级联反应诱导SMMC-7721细胞凋亡。

XIAP是最有效的内源性Caspases抑制因子，其在多种肿瘤细胞中过表达[11]。XIAP抑制细胞凋亡的机制主要是XIAP的BIR2结构域与Caspase-3、Caspase-7结合，而XIAP的BIR3结构域与Caspase-9结合，从而抑制细胞凋亡[12]。本研究结果表明40.91 μg/mL透骨草提取物处理SMMC-7721细胞24 h，XIAP蛋白表达水平与对照组相比显著增高，说明透骨草提取物通过抑制XIAP，进而通过Caspase级联反应诱导SMMC-7721细胞凋亡。

总之，透骨草提取物能通过XIAP/Caspase信号通路诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡，透骨草提取物是否通过其他的凋亡相关蛋白诱导SMMC-7721细胞凋亡,有待进一步深入研究。

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