曾祥华，杨 军，田 浩，刘琳琳，胡 宁

（重庆大学生物工程学院生物流变科学与技术教育部重点实验室视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室，重庆 400030）

0 引言

表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）技术是一种重要的生物化学检测分析方法，具有检测精度高、样品不需标记、不需分离纯化、可实时动态监测［1］等优点，已经广泛应用于生物医学、食品安全以及环境监测等领域［2］。传统的 SPR检测装置体积庞大、价格昂贵［3］，为了满足越来越广泛的检测需求，便携式、小型化SPR生物传感器的研究得到了广泛关注。其中，美国德州仪器（Texas Instruments，TI）公司生产的 Spreeta传感器［4］最具代表性。该传感器采用Kretschmann结构，光源采用近红外光LED，检测器采用线阵硅光二极管，体积非常小。但是，该传感器只是一个独立传感模块，需要另外配备流通系统、数据采集模块以及控制电路等。

因此，本文在此基础上进行了大量改进，采用了尺寸更大、光学性能更好的不规则四边形玻璃棱镜，光学检测精度和系统集成方面也有了很大提高。同时，系统集成了用于生物样本溶液流动的流路结构和光学信号采集及分析模块，实现了一个完整的小型化SPR生物传感检测装置原型。

1 传感器设计与实现

1．1 基本原理

SPR是一种物理光学现象。当入射光以大于临界角入射到2种不同折射率的介质界面（如玻璃与其表面的金）时，可引起金属中自由电子的共振。自由电子吸收了入射光的能量，从而使反射光有一定程度的衰减，其程度与入射角度相关。使反射光下降到最小的入射角称为SPR角，它的大小依赖于紧靠在金属薄膜一侧的表面介质的折射率。由此可以通过检测SPR角来判定介质的变化。

1．2 系统结构

SPR生物传感器（图1）主要包括光学、传感反应、检测、流通、数据采集等模块以及计算机，能够实现SPR检测、待测物的进出样以及检测信号的采集、显示与分析等。检测时，红光二极管发出一束发散光入射到一侧镀有金膜的传感芯片。由于入射光为同一点光源产生的发散光，包含了一定的入射角范围。当满足共振条件时，某一角度入射光会在敏感芯片上发生SPR共振。光束通过反光镜反射到线阵CCD上，线阵CCD［5］上不同的像素点对应着不同的入射角，当检测到某一区域像素点的光强明显减弱时，其对应的角度就是SPR共振角。

图1 小型化SPR传感装置Fig 1 Miniaturized SPR sensing device

1．3 光学系统

SPR共振角大小与待测样品种类、浓度密切相关。入射光角度变化范围和可检测反射光范围越大，能够检测的共振角范围和样品种类越多、浓度变化范围也越大。为了使可检测的入射光角度尽量大，对光源（LED）的位置、传感界面的尺寸（图2中b面）和传感界面与光源所在表面的夹角（图2（a）中θ）进行了优化。

图2 棱镜结构Fig 2 Prism structure

棱镜外形为六面体（图2），光路所在截面为一个不规则四边形。优化后，四边形abcd边长分别为6，4，4．6 cm和1．1 cm，棱镜与光路界面垂直方向的厚度为2cm。棱镜b面贴有传感芯片和流通池;c面为反射面，能够将光反射到线阵CCD上。为了增加入射光的检测范围，在尺寸允许的情况下，使b面的尺寸尽可能大。b面与a面的夹角θ为60°，在θ角不是太大（照射在b面上的入射光角度范围大）的同时，兼顾了2次反射过程中的光路设计。a面下方左侧装有LED，右侧装有线阵CCD，实现光的发射和接收。LED的位置对入射光检测范围的影响比前2个因素稍小，需要考虑的是LED和CCD能保持在光路中的确定位置，并具有一定的间距，尽量减少棱镜中不同部位的反射光对检测结果的干扰。LED距离a面左端7 mm，线阵CCD中心点距离a面右端27 mm。与TI Spreeta传感器的棱镜（1．6 cm×0．9 cm ×1．2 cm ×0．7 cm）相比，本装置棱镜尺寸较大，可以增加入射角度范围（从Spreeta传感器的4°增加到13°），可检测样本种类和浓度变化范围大大增加。同时，玻璃比TI Spreeta传感器中的塑料透光性更好，光学性质受温度影响也更小，其折射率随温度变化率（10－6K－1）仅为光学塑料的1/60［6］，因此，可检测样品的折射率范围和稳定性更高。

TI Spreeta传感器光源采用波长为830 nm的近红外光LED。已有研究［7］表明，在入射光波段为630～670 nm时，SPR共振峰最尖锐，曲线效果最好，所以，本装置采用波长为670 nm的红光LED。TI Spreeta的光电检测器采用像素点为128的线阵硅光二极管，角度分辨率在0．1°数量级，而本装置采用的线阵CCD像素点为5000（TCD1501D，日本东芝），角度分辨率在0．01°数量级，检测精度有显著提高。同时，高像素点线阵CCD比机械扫描装置体积更小。由于不同角度的入射光通过2次反射到达CCD检测面的路径有所差异，入射角与CCD检测点的距离变化并不是线性相关的，需要做一些修正:从0像素点开始，每隔100像素点分别计算其对应的入射角度值，直至5 000像素点，然后对这50个入射角度值进行拟合，利用拟合来保证了像素点与入射角度之间对应关系。

光路中除了光源、棱镜、检测器，还包括敏感界面和反光镜这2个反光表面。TI Spreeta直接将金膜镀在棱镜表面作为敏感面，金膜使用次数非常有限，如果金膜损坏，必须更换棱镜。由于光学性能好的棱镜制作昂贵，这也限制了其广泛应用。本文中，敏感芯片［8］采用一侧镀有金膜的盖玻片，通过匹配油粘贴在棱镜表面。敏感芯片成本低，在损坏后可以直接抛弃。棱镜顶面安置的反光镜可以反射入射光束，使光源和光检测器位于同一平面内，简化了装置结构，也减小了体积。反光镜的反射率高达90%，能够有效减少光能量的损耗。

1．4 流通模块

SPR生物传感分析的待检测样品大多是溶液，需要在系统中集成流通模块来实现样品的流入、分析和流出。一个完整的流通模块主要由样品池、通道和流体驱动机构组成（图3）。为了保证样品溶液连续稳定流动，采用TJP—3A/W0109—1B注射泵（中国格兰）进行液体输送。注射泵一次注射的容量范围为 5 μL～60 mL，线性速度范围为7．94 μm/min～ 79．4 mm/min，可完成灌注、抽取、先灌注后抽取和先抽取后灌注4种传输模式，并能够实现样品溶液的微量恒流。

为了达到较高的检测精度，足够大的敏感界面也同样重要。检测系统采用了5 mm×12 mm的敏感界面。六边形流通池用聚二甲基硅氧烷（poly-dimethylsiloxane，PDMS）加工制成，能够提高液体流动的稳定性与均匀性［9］。流通池中间区域的面积与敏感界面相当，深度为2 mm，两端接上细软管，一端为进样端，另一端为出样端。

图3 流体驱动模块Fig 3 Fluid driving module

1．5 数据采集模块

数据采集模块核心芯片为FX2CY7C68013（CYPRESS公司），该芯片集USB 2．0收发器、串行接口引擎、增强的8051内核、I2C总线接口和通用可编程GPIF于一体，大大提高了数据传输速率。它读入线阵CCD检测到的光强，进行A/D转换，然后通过USB总线输出。行同步脉冲的上升沿对应于CCD有效像元输出的开始，像元同步脉冲的上升沿则对应于每个像元输出的有效部分。行同步脉冲周期则是积分时间，积分时间和驱动频率的设置由接口软件给出，其采样频率最高可达20 MHz。

软件采用微软公司的Visual C++6．0开发，主要功能是对数据采集系统进行设置，并对数据进行存储和显示。

2 实验分析

为了测试新研制的SPR传感检测系统的线性度和稳定性，利用水、空气及不同浓度的乙醇溶液进行了共振检测分析。

2．1 线性度分析

SPR检测系统的线性度可以通过检测已知折射率溶液的共振角得出。配制体积分数为2%～20%的乙醇溶液，以2%递增。对不同体积分数的乙醇溶液进行10次检测，得到共振角与折射率的关系曲线（图4）。结果表明:随着乙醇体积分数的增大，折射率逐渐增大，其共振角也逐渐增大。

图4 折射率—共振角拟合直线Fig 4 Fitting straight line of refractive index vs resonance angle

通过最小二乘法得到拟合直线方程为:y=135．6x－116．6，相关系数R=0．996 5，表明该SPR检测仪器具有很高的检测线性度。

2．2 稳定性分析

稳定性是衡量SPR检测仪器的另一个重要指标，它可以通过重复测量得到的共振角标准偏差（SD）和相对标准偏差（RSD）来判定。若标准偏差和相对标准偏差值较小，则稳定性较好;反之，亦然。

在相同条件下，分别对空气和水进行10次重复实验，结果如表1。

表1 空气、水共振角及均值、标准偏差、相对标准偏差Tab 1 Resonance angle，standard deviation，relative standard deviation of air and water

结果表明:空气的SPR共振角为51．993°，标准偏差为0．157°，相 对 标 准 偏 差 为 0．30%;水 的 SPR 共 振 角 为64．042°，标准偏差为0．133°，相对标准偏差为 0．21%。空气和水的相对标准偏差均小于0．5%，因此，本系统具有很好稳定性。

3 结论

本文在TI Spreeta传感器的基础上，改进了光路结构并集成了流路和检测系统，形成了一个完整的SPR传感检测设备。在光路结构中，改进了棱镜的外形尺寸和材料，增大了光源入射角度范围，可以进行更多样品的SPR检测。同时，采用波长630 nm的红光LED，增加了SPR峰的深度，能够更加准确地确定SPR共振角的位置，提高了检测精度和灵敏度。采用高像素点线阵CCD，也有助于获得更高的检测精度。传感芯片采用一侧镀有金膜的盖玻片，大大降低了成本，可以重复使用。在新建立的SPR实验装置上利用空气、水和不同体积分数的乙醇进行了多次传感检测分析。实验研究表明:该装置不仅能够对单一样本进行精确检测，而且重复性、线性度和稳定性都很好。

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