曾春芳，万译文，李小玲，刘 丽

(农业部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙)，中国长沙 410153)

硝基呋喃类代谢物属于一种人工合成的广谱抗菌药物，它主要包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃它酮等.硝基呋喃类由于具有杀菌性而被广泛应用于畜禽和水产等动物传染病预防与治疗［1-3］.该类药物半衰期短，在动物体内代谢速度快，与蛋白结合的代谢物产生稳定的残留，形成的代谢产物3-氨基-2-噁唑烷酮(AOZ)、3-氨基-5-吗咻代甲基-2-噁唑烷酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、1-氨基乙内酰脲(AHD)均可使动物发生癌变和基因突变，人类长期使用可对其健康产生危害［4-6］.欧盟在1995年已全面禁止呋喃类抗菌药物作为生长剂和杀菌剂用在饲料中，我国也于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类药物的公告.由于硝基呋喃在动物体内代谢速度快，不容易在动物组织中被检测到，通过14C标记表明［7］，硝基呋喃代谢物在动物体内以蛋白结合物的形式存在，在体内能残留数周，这些结合残留物可通过在适当的酸性条件下释放出来，以达到检测硝基呋喃残留的目的［8］.

由于液相色谱串联质谱方法灵敏度高，前处理方法简单快速，可同时用于产品的检测和确证，农业部颁布了相关的标准采用液质法应用于食品当中硝基呋喃类代谢物的残留检测［9-10］.该方法操作简单，成本较低，回收率满足要求，但是由于水产品成分比较复杂，基质中含有大量的脂肪、蛋白质等杂质，前处理过程中没有采取进一步的净化，流动相溶解后会有乳化现象产生，容易产生基质效应，而且会对仪器造成污染影响结果的准确性，导致假阳性的情况出现.本文建立了水产品中硝基呋喃类代谢物的液相色谱串联质谱检测方法，通过在前处理过程中采取固相萃取柱进行净化，减少样品带来的基质效应，提高了色谱分析的功效，简单快速，灵敏度高，而且节约成本，能够实现药物残留的快速检测，可以满足水产品质检以及相关基础研究的要求.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo TSQ Quantum液相色谱-高分辨串联四级杆质谱联用仪(配用电喷雾离子ESI源);旋转蒸发仪(瑞士布奇公司);高速冷冻离心机(日本日立公司);超声波清洗器(昆山超声波仪器厂);精密电子天平(梅特勒—托利多称重设备系统有限公司);微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂).

AHD、SEM、AMOZ、AOZ 标准品(德国 R-Biopharm 公司);AHD-13C3、SEM-15N13C、AMOZ-D5、AOZ-D4(德国Witega公司);二甲基苯甲醛(色谱纯，美国Fluka公司);二甲亚砜(色谱纯，美国Fluka公司);甲醇、乙腈(色谱纯，美国Tedia公司);正己烷(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司);乙酸铵(色谱纯，美国Fluka公司);甲酸(色谱纯，美国Fluka公司);浓盐酸(优级纯，国药集团化学试剂有限公司);磷酸氢二钾(分析纯，天津光复科技发展有限公司);固相萃取HLB柱(3 mL，60 mg，美国Waters公司).

标准储备液的配置:分别称取硝基呋喃类标准品各10.0 mg，用甲醇溶解后转移至100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容配置成100 mg/L的标准储备液，在－18℃下避光保存.使用时将上述标准储备液混合，用甲醇稀释成 0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/L 不同浓度的标准工作液.

内标储备液及使用液的配置:分别称取10.0 mg各内标标准品，用甲醇溶解并定容，配成100 mg/L的标准储备液，在－18℃下避光保存.准确吸取各内标储备液，用甲醇逐级稀释配成0.01 mg/L的混合内标使用液，在－18℃下避光保存.

1.2 色谱质谱条件

色谱柱:Thermo Scientific Hypersil GOLD C18(2.1 mm ×100 mm，5 μm);柱温:30℃，流动相 A 为甲醇;B为2 mmol/L的乙酸铵溶液(含0.1%的甲酸);进样体积:10 μL;流速:0.25 mL/min，流动相梯度见下表1.

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 Elution process of the separation

采用电喷雾离子源(ESI);喷雾电压:4.1 kV;离子传输毛细管温度:350℃;碰撞气氩气压力:0.1 Pa;鞘气流量:40 arb;辅助气流量:30 arb;扫描模式:多反应监测(SRM);硝基呋喃类代谢物的母离子、子离子和碰撞能量见表2.

表2 8种药物的SRM采集参数和标准曲线Tab.2 SRM parameters and linear equations for 8 drugs

1.3 样品前处理

称取2 g样品至于50 mL离心管中(精确至0.01 g)，加入200 μL 0.01 mg/L的混合内标溶液，再加入5 mL 0.2 mol/L盐酸溶液和0.2 mL 0.5 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，在漩涡混合仪上充分混合1 min.置于恒温水浴振荡器中(37℃)避光振荡16 h，取出离心管冷至室温，加入5 mL 1.0 mol/L磷酸氢二钾溶液，调节pH至7.0～7.5，加入8 mL正己烷漩涡混匀后放入离心机离心10 min(6 000 r/min)，分层后取下层水相待过柱，固相萃取柱(HLB，3 mL，60 mg)依次用3 mL甲醇，6 mL水活化，取备用液过柱，采用在大气压力下自然过柱.过完样品后，加入3 mL水淋洗并抽干.用4 mL乙酸乙酯分2次洗脱，洗脱液于40℃氮气吹干后，加入1.0 mL流动相溶解残渣，再加入2.0 mL正己烷放入离心机离心5 min(5 000 r/min)，取下层液体过0.22 μm滤膜，滤液供液相色谱-质联用仪测定.

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的选择及优化

考察了甲醇与2 mmol/L的乙酸铵溶液不同体积比例(5∶95、10∶90、15∶85、20∶80)的混合液作为流动相时对目标物分析的影响，综合考虑目标物的响应值和出峰的时间、峰形的尖锐性，本文选择2 mmol/L的乙酸铵溶液:甲醇(V∶V=80∶20)为本实验的最佳流动相.由于水产品成分比较复杂，基质中含有大量的脂肪、蛋白质、碳水化合物以及色素等杂质.本文比较了在调节pH后加入8 mL正己烷离心和加入流动相后再加入2 mL正己烷离心2种不同的净化方式，这2种方式去脂的效果均不错，溶液也较澄清，但是第二种净化方式，回收率较低，在60%以下，第一种净化方式的回收率满足试验要求.

2.2 固相萃取实验

固相萃取是一种色谱分离的前处理方法，主要依靠固相萃取柱来进行净化，不同的基质选择不同材料的固相萃取柱，填料的类型决定了吸附能力的大小以及回收率的高低，本文比较了4种不同的固相萃取柱(C18500 mg/3 mL，HLB 60 mg/3 mL，MCX 150 mg/6 mL，Alumina-N 60 mg/3 mL)对硝基呋喃类代谢物的净化效果，其回收率的结果见图1，本实验选用HLB柱作为硝基呋喃类代谢物的固相萃取柱，回收率均满足要求.

固相萃取过程中的洗脱液一般选择甲醇、乙腈或者乙酸乙酯，本实验采用乙酸乙酯作为洗脱液，得到良好的洗脱效果.洗脱方式主要考察了一次4 mL、4 mL分2次以及9 mL分3次的3种洗脱方式，从实验结果(表3)来看，当用4 mL乙酸乙酯溶液进行洗脱时，目标物洗脱不完全，还有部分目标物在组合SPE柱上没有被洗脱下来;当用分2次洗脱时(2×2.0 mL)，目标物被完全洗脱，回收率良好;当用洗脱液分3次洗脱时(3×3.0 mL)，回收率与2次洗脱淋洗时差不多，因此本实验选择操作简单、节约试剂的2×2.0 mL分2次洗脱的方式.

图1 不同固相萃取柱的硝基呋喃类代谢物回收率Fig.1 Recoveries of metabolites of nitrofuran on different SPE columns.

表3 洗脱方式对回收率的影响Tab.3 Influence of elute style on recovery

2.3 色谱条件的选择及优化

流动相的pH值会影响目标物在色谱柱中的分离.本实验考虑采用挥发性电解质乙酸铵来做为流动相，同时加入0.1%甲酸控制流动相pH值，采用合适的梯度洗脱程序，不但很好地实现了各种目标物的分离，并且得到了比较理想的色谱峰，峰形尖锐且对称性好，增大了分子离子峰的峰强度.在8 min内，各种硝基呋喃类代谢物均得到了较好的分离.色谱图见图2.

2.4 质谱条件的选择及优化

根据硝基呋喃类代谢物的结构特征，采用ESI正离子电离模式，以流动注射泵连续进样对1.0 mg/L的标液进行Q1全扫描，扫描范围为200～400 m/z之间，得到每种组份的分子离子，分别向其分子离子施以碰撞能量形成子离子，接着进行子离子全扫描，找出丰度最强的碎片离子为定量离子，丰度次强的碎片离子为定性离子.同时优化锥孔电压、碰撞能量、鞘气与辅助气流量等质谱条件，使母离子和子离子组成的特征离子的丰度和比例达到最佳.得到1.2中最佳质谱条件.

2.5 线性范围和灵敏度

配置0.5、1.0、5.0、20.0、50.0 μg/L 的系列标准工作溶液，采用内标法定量，以待测物的质量浓度 X(μg/L)为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值Y为纵坐标制作标准曲线，得到硝基呋喃类代谢物的回归方程和相关系数(见表2).由表2可知，硝基呋喃类代谢物在0.5～50.0 μg/L在范围内其标准曲线的线性关系良好，相关性系数R2在0.997以上.在方法规定的取样质量条件下，在阴性样品中添加2种混合标准溶液(添加水平为0.25 μg/kg)经测定信噪比(S/N)均大于3，表明这4种物质的检测下限(LOD)为0.25 μg/kg，在阴性样品中添加2种混合标准溶液(添加水平为0.5 μg/kg)经测定信噪比(S/N)均大于10，表明其定量下限(LOQ)可为 0.5 μg/kg.

2.6 回收率与精密度

向草鱼、中华鳖和对虾阴性样品中分别添加5、20、100 ng/g 3个水平的添加实验，每个添加水平进行3次实验，每次平行测定6次，按1.2节所述条件进行加标回收率实验，所得结果为回收率为68.6% ～106.2%，相对标准偏差为1.2% ～10.3%，符合国内外有关标准和法规的要求，结果见表4.

图2 鱼肉中硝基呋喃类代谢物(25.0μg/L)及其内标溶液的提取离子流色谱图Fig.2 Extraction ion chromatograms of metabolites of nitrofuran(25.0μg/L)in fish and their internal solution

表4 4种药物在空白样品中的添加回收率和相对标准偏差(n=6)Tab.4 Recoveries and relative standard deviations of four drugs in blank samples

3 小结

通过对前处理条件、色谱条件以及质谱条件的优化，建立了水产品中硝基呋喃类代谢物残留的检测方法.结果表明，该方法在0.5 ～50.0 μg/L 范围内，硝基呋喃类代谢物检测下限(LOD)为0.25 μg/kg，其定量下限(LOQ)可为0.5 μg/kg;在3个不同的添加水平下，其回收率为68.6% ～106.2%，相对标准偏差为1.2% ～10.3%.本方法前处理步骤简单、回收率稳定、精密度好，满足我国以及欧盟等国家的限量要求，可以作为水产品中硝基呋喃类代谢物的检测方法，并可为该类药物在水产品中的消除规律及毒理评价提供灵敏、准确的分析手段，对水产品中硝基呋喃类代谢物的溯源和卫生监督提供了技术支撑.

［1］葛宝坤，王云风，常春艳，等.测定鸡肉、水产品中四种硝基呋喃类药物残留量的固相萃取-液相色谱法［J］.分析测试学报，2003，22(5):91-93.

［2］GREGORY O N，TIMOTHY H B，GREGORY W D.Semicarbazide formation in flour and bread［J］.J Agric Food Chem，2008，56(6):2064-2067.

［3］孙言春，张 洁，牟振波，等.固相萃取液相色谱串联质谱测定水产品中硝基呋喃类代谢物残留研究［J］.中国渔业质量与标准，2011，1(2):54-59.

［4］VAN KOTEN-VERNELEN J E M.Report of the 40th meeting of the JECFA world health organization［R］.Geneva:JECFA，1993，85:85-90.

［5］CHANG C，PENG D P，WU J E，et al.Development of an indirect competitive ELISA for the detection of furazolidone marker residue in animal edible tissues［J］.J Agric Food Chem，2008，56(1):1525-1531.

［6］张会彩，李 军，闫晓东，等.高效液相色谱法检测饲料中7种硝基呋喃类药物［J］.中国兽医杂志，2011，47(5):72-74.

［7］VAN DE WATER C，HAAGSMA N.Analysis of chloramphenicol residues in swine tissues and milk:comparative study using different screening and quantitative methods［J］.J Chromatogr B，1991，566(1):173-185.

［8］徐建飞，王 伟，杜晓宁.LC-MS/MS在硝基呋喃类兽药残留检测中的应用概述［J］.中国兽药杂志，2012，46(10):46-49.

［9］中华人民共和国农业部.农业部781号公告-4-2006动物源性食品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 高效液相色谱-串联质谱法［S］.北京:中国标准出版社，2006.

［10］中华人民共和国农业部.农业部783号公告-1-2006水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 高效液相色谱-串联质谱法［S］.北京:中国标准出版社，2006.