张丽佳，薛 银，张岑容，胡松华

(浙江大学动物科学学院动物医学系，杭州 310058)

奶牛子宫内膜炎多数是由产后子宫感染细菌引起的一种炎症反应，该病可造成奶牛妊娠推迟，繁殖率下降，甚至不孕［1］。据报道，从患病奶牛子宫内分离到的细菌主要有葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、棒状杆菌、粪肠球菌、芽孢杆菌、变形杆菌、克雷伯氏菌、沙门氏杆菌等［1－3］。奶牛子宫内膜炎常用在子宫内灌注抗菌药物的方法进行治疗。抗生素治疗的一个直接后果是造成牛奶中药物残留，危害食品卫生［4－5］。为了减免抗生素对牛奶的污染，我国一些奶牛场采用中草药或其提取物防治奶牛子宫内膜炎，其中以桉油精及其制剂比较常见。桉油精为一种味似樟脑的无色液体，属单萜类化合物，主要存在于桉叶、迷迭香、番石榴等植物挥发油中［6］，具有抗菌、抗炎、杀虫、镇痛、促进透皮吸收等作用［7－9］。桉油精可作为皮肤渗透增强剂、鼻血管收缩剂、镇咳剂、消毒剂、杀虫剂、芳香剂等应用于医药、工业、香料行业中［10－11］。由于奶牛子宫内膜炎主要是由细菌感染引起的一种炎症反应，在治疗时需考虑杀灭病原和促进炎症消散两个方面。本文研究了桉油精对37株子宫内膜炎临床分离菌株的体外抗菌作用及其对人工致炎症作用的影响，为临床上采用桉油精治疗奶牛子宫内膜炎提供实验依据。

1 材料

1．1 药品 桉油精，浙江金大康动物保健有限公司产品，批号20120409;地塞米松磷酸钠注射液，河南龙源药业股份有限公司，批号11083001。

1．2 细菌 在2010～2011年期间从奶牛子宫内膜炎病例分离到的分离株，其中大肠杆菌9株、金黄色葡萄球菌8株、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)6株、停乳链球菌4株、无乳链球菌4株、乳房链球菌4株、沙门氏菌2株。以上细菌保存于浙江大学动物科学学院中兽医实验室。

1．3 实验动物 ICR小鼠，清洁级，体重25～30 g，雄性，购自上海西普尔－必凯实验动物有限公司。

1．4 试剂及仪器 MH肉汤、MH琼脂，杭州微生物试剂有限公司;依文思兰(Evans blue)，Fluka进口分装，上海化学试剂采购供应站经销;吐温－80，浙江省温州清明化工有限公司;琼脂粉、二甲苯，国药集团化学试剂有限公司;恒温培养摇床，QYC－200型，上海福玛实验设备有限公司;立式压力蒸汽灭菌器，LS－B50L型，上海华线医用核子仪器有限公司;洁净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;酶标仪，Multiskan，MK3，美国 Thermo 公司;独立送风饲养笼具，IVC－II型，苏州市冯氏实验动物设备有限公司。

2 方法

2．1 抗菌作用研究

2．1．1 细菌培养 将上述7种细菌分别接种于MH肉汤中，37℃孵育6～8 h。用生理盐水校正浓度至0．5麦氏比浊标准，约含1×108CFU/mL。

2．1．2 最小抑菌浓度(MIC)测定 参照文献［12］，取试管12支，编号。第1管中加入MH肉汤1．6 mL，2～10管每管加入1 mL，再在第1管加入桉油精0．4 mL(372 mg)混匀，然后吸取1 mL至第2管，混匀后再吸取1 mL至第3管，如此连续倍比稀释至第10管;1～10管分别加入菌液10μL，使每管的菌液浓度为1×106CFU/mL;第11号管加入MH肉汤2 mL和菌液10μL作为阳性对照;第12管加入MH肉汤2 mL和桉油精10μL作为阴性对照。将接种后的试管置于37℃培养24 h后观察结果，以肉眼未见细菌生长的最低药物浓度为受试菌的MIC。

2．1．3 最低杀菌浓度(MBC)测定 参照文献［13］，从以上未见细菌生长的试管中每管取100μL接种于MH琼脂平板，涂布均匀，37℃培养24 h后观察结果，以未见细菌生长的最低含药浓度为MBC。

2．2 抗炎作用研究

2．2．1 小鼠耳肿胀实验 参照文献［14］，取雄性ICR小鼠40只，称重，体重25～30 g，随机分成5组:三个桉油精处理组，用2%吐温－80稀释桉油精，得浓度为100、200、400 mg/mL三种溶液，按照100、200、400 mg/kg三种剂量灌胃给药;阳性药物对照组腹腔注射给药(地塞米松，5 mg/kg);空白对照组2%吐温－80灌胃给药(10 mL/kg)。各组动物连续给药3 d，每天1次。末次给药0．5 h后，取二甲苯20μL/只涂布于小鼠右耳前后两面，每面各10μL，左耳不作处理;0．5 h后，沿耳廓剪下双耳，用9 mm直径打孔器在两耳相同部位打孔，称重，并计算肿胀度、肿胀抑制率及耳增重百分比。肿胀度=右耳片重－左耳片重，肿胀抑制率=(空白组肿胀度－给药组肿胀度)/对照组肿胀度，耳增重百分比=耳肿胀度/左耳重×100%。

2．2．2 小鼠腹腔毛细血管通透性实验 参照文献［15］，取雄性ICR小鼠24只，称重，体重25～30 g，随机分成4组:桉油精组(200 mg/kg)、桉油精组(400 mg/kg)、阳性组(地塞米松:5 mg/kg)以及空白组(2%吐温－80);给药方式同2．2．1项。末次给药45 min后小鼠尾静脉注射0．5%依文思兰0．1 mL/10 g，同 时 立 即 腹 腔 注 射 0．6% 醋 酸0．2 mL/只;30 min后处死并用5 mL生理盐水冲洗腹腔，收集腹腔液，3500 r/min离心5 min;取上清，测定OD630。

2．2．3 统计分析 实验数据表示为平均值±标准差(x±s)，采用 SPSS(11．5)统计软件中 One－Way ANOVA方差分析，比较不同组之间数据的差异性，P＜0．05，即判定为差异性显著。

3 结果与分析

3．1 桉油精的抗菌作用 桉油精对37株供试菌的最小抑菌浓度及最低杀菌浓度结果见表1。桉油精对7种细菌均有一定的抗菌作用，其中对大肠杆菌的抗菌作用最明显，MIC和 MBC分别为3．9、6．0 mg/mL;对金黄色葡萄球菌的抗菌作用最弱，MIC 和 MBC 分别为12．4、18．2 mg/mL。综合比较7种细菌的抗菌作用，桉油精的抗菌活性由强到弱分别为:大肠杆菌、乳房链球菌、沙门氏杆菌、无乳链球菌、CNS、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌。

表1 桉油精对奶牛子宫内膜炎分离菌的最小抑菌浓度(M IC)和最低杀菌浓度(MBC) mg/m L

3．2 桉油精对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响 结果见表2。给药组小鼠耳肿胀程度显著低于空白组，桉油精中、高剂量组及地塞米松阳性药物组的肿胀度极显著低于空白对照组;二甲苯引起各组小鼠耳肿胀的程度由高到低依次为空白对照组＞100 mg/kg桉油精组＞200 mg/kg桉油精组＞地塞米松组＞400 mg/kg桉油精组。

表2 桉油精对二甲苯所致小鼠耳肿胀度、肿胀抑制率及耳增重百分比

3．3 桉油精对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响由表3可见，桉油精和地塞米松可抑制依文思兰染料渗出，与空白组比较，400 mg/kg桉油精组及地塞米松阳性药物组可显著性抑制染料渗出。

表3 桉油精对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

4 讨论

桉油精属单萜类化合物，主要存在于桉叶、迷迭香、番石榴等植物的挥发油中，尤以桉叶油含量最多，可达70%以上。Oyedeji等［7］研究发现，生长在尼日利亚的赤桉油、柳桉油、白桉油、剥桉油对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均有抑制效果，它们在5 mg/mL的浓度下都有一定的抑菌活性;Ponce等［6］采用琼脂扩散法研究了蓝桉油的抗菌活性，表明其最小杀菌浓度为0．93～15μL/mL。本文选取临床上分离的7种奶牛子宫内膜炎主要致病菌研究桉油精的抗菌活性，结果显示，桉油精对7种细菌均有抑制作用，抗菌活性由强到弱分别为:大肠杆菌、乳房链球菌、沙门氏杆菌、无乳链球菌、CNS、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌，平均 MIC为3．9～12．4 mg/mL，平均 MBC 为 6．0 ～18．2 mg/mL，与文献报道［6］基本一致。

奶牛子宫内膜炎是临床上常见的奶牛疾病之一，是造成不孕症的重要原因之一，发病原因主要是奶牛产后细菌感染引起。根据临床表现不同，可分为急性子宫内膜炎和慢性子宫内膜炎［16］，但无论是急性还是慢性，其临床表现主要是炎症反应，因此在研究中药治疗奶牛子宫内膜炎药理作用时，中药抗炎作用是一项必不可少的指标。白峰等［15］对大叶桉叶挥发油的抗炎活性进行研究，表明大叶桉叶油对急慢性炎症模型表现出较强的抗炎活性;此外，文献报道蓝桉油中主要成分桉油精具有消炎镇痛作用，可用于治疗呼吸道炎症，如气管炎、哮喘等［10，17］。本研究设计小鼠耳肿胀和腹腔毛细血管通透性增加两种炎症模型以考察桉油精的抗炎活性。结果显示，桉油精能够明显抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀，高剂量(400 mg/kg)给药时对腹腔毛细血管通透性增加亦有显著的抑制作用，表明桉油精具有抗炎作用，给药剂量为400 mg/kg时效果最佳，其抗炎实验结果为进一步研制治疗奶牛子宫内膜炎的有效中药组方提供坚实的理论依据。

随着抗生素治疗奶牛子宫内膜炎方法的广泛应用，牛奶中抗生素残留及细菌耐药性增加等问题也随之产生。近年来，中药因其安全、低毒、低残留而逐渐成为治疗奶牛子宫内膜炎的新趋势。本实验结果表明桉油精不仅对奶牛子宫内膜炎主要致病菌有抑制作用，而且能够促进炎症的消散，提示桉油精可用于治疗奶牛子宫内膜炎，并且有必要进一步研究其对奶牛子宫内膜炎的临床治疗效果。

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