王 敏，王逢春，郝影霞，李 翔

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch．)Bge．var．mongholicus(Bge．)Hsiao或膜荚黄芪 Astragalus membranaceus(Fisch．)Bge．的干燥根，主要有效成分为皂苷和黄酮类化合物，其具有清除氧自由基，抑制脂质过氧化和维持血中NO浓度，保护缺血再灌注损伤等多种药理活性［1-3］。目前，高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)指纹图谱在黄芪药材质量评价中的研究已经逐步深入，发挥了重要的作用。前期的研究发现，尽管采用相同的色谱条件和方法，不同的色谱柱会使得到的HPLC指纹图谱产生一定的差异，也将会影响相似度的计算结果［4-7］。目前，针对色谱柱在HPLC指纹图谱研究的作用及相应的评价开展较少，尚未形成系统的研究理论和有效的评价方法，故有待于进一步的研究［8-9］。为保证色谱条件具有更好的耐用性和稳定性，参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》的相关规定，对黄芪药材高效液相色谱－二极管阵列检测法(HPLC-DAD)指纹图谱所采用的色谱柱进行考察，并结合统计学方法对相似度计算结果进行分析评价，以更好地保证黄芪药材HPLC-DAD指纹图谱的适用性和稳定性，提高黄芪药材指纹图谱的评价能力。现报告如下。

1 仪器和试药

Dionex高效液相色谱仪:P680 Pump泵，PDA-100二极管阵列紫外检测器，Dionex Chromeleon工作站，TCC-100柱温箱，ASI-100自动进样器;上海淀久DJ-04药材粉碎机;METTLER AE240电子天平;CQF-I-6型超声仪。黄芪药材由上海华宇药业有限公司GAP试验基地提供并鉴定为膜荚黄芪的干燥根。甲醇和乙腈为色谱纯;水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:A柱:依利特 Hypersil ODS 2 柱 (4．6 mm × 250 mm，5 μm，柱 号:E1417176);B 柱:汉邦 Lichrospher C18柱(4．6 mm ×250 mm，5 μm，柱号:03201255);C 柱:迪马 DiamonsilTMC18柱(4．6mm ×250 mm，5 μm，柱号:99903);流动相:A相为乙腈－甲醇(体积比9∶1)，B相为水，梯度洗脱。A相含量随时间的变化:5%(0～5 min)，5%～20%(5～8 min)，20%(8～15 min)，20%～30%(15～18 min)，30%～45%(18～35 min)，45%～80%(35～38 min)，80%～95%(38～60 min);流速 1．0 ml/min;柱温为室温;检测波长260 nm;进样量20 μl，进样前以流动相梯度初始条件平衡15 min。

2.1 样品溶液的制备 取药材粗粉2．0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇100 ml，超声处理20 min，滤过，滤渣用甲醇洗涤3次，每次20 ml，合并滤液减压回收溶剂，转移至5 ml量瓶中，定容，摇匀，0．45 μm 滤膜滤过，弃去初滤液，取续滤液，即得，置于4℃冰箱保存。

2.3 方法学考察

2.3.1 稳定性试验:将黄芪药材样品溶液分别在0、3、6、12、24、48 h 进样检测，考察样品溶液的稳定性。结果表明，色谱峰的相对保留时间、相对峰面积精密度(RSD)均＜2．7%，表明样品溶液在48 h内基本稳定。

2.3.2 精密度试验:将黄芪药材样品溶液连续进样5次，考察精密度。结果表明，所有色谱峰的相对保留时间 RSD均≤1．5%，相对峰面积 RSD均≤1.8%，表明仪器的RSD良好。

2.3.3 重复性试验:制备5份黄芪药材样品溶液并进行检测，考察方法的重现性。结果表明，所有色谱峰的相对保留时间 RSD均 ＜1．5%，相对峰面积RSD均＜2．6%，表明方法的重现性良好。

2.4 指纹图谱的建立 按照“2．2”项下方法制备黄芪药材样品溶液，分别采用不同色谱柱依次进样，记录色谱图，按照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》建立HPLC-DAD指纹图谱(图1)。

图1 10批次黄芪药材高效液相色谱－二极管阵列检测法3种色谱柱叠加色谱图

由图1可以看出，10批次黄芪药材在3种色谱柱的图谱轮廓比较接近，其相对保留时间和相对峰面积也基本一致，具有较高的相似性。但从C柱的色谱图中可以发现其中部分色谱峰出现托尾的情况，其理论板数也低于A柱和B柱的相应色谱峰，存在较为明显的差异。

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2．0版》自动匹配10批次黄芪药材HPLC-DAD图谱的相关参数，标定其中匹配数目为10的11个色谱峰为共有指纹峰，共有指纹峰面积均＞色谱峰总面积的90%。

2.5 相似度的计算及统计分析 采用夹角余弦法对3种色谱柱中黄芪药材的HPLC-DAD指纹图谱进行相似度计算，并采用SPSS 16．0统计软件进行配对t检验，结果见表1、2。

表1 10批次黄芪药材高效液相色谱－二级管阵列检测法指纹图谱相似度计算结果

表2 3种色谱柱获取的高效液相色谱－二级管阵列检测法指纹图谱相似度配对t检验结果

由表2可以看出，A柱和B柱色谱间相似度差异无统计学意义(P＞0.05)。而C柱与A柱和B柱间的相似度差异有统计学意义(P＜0.05)。从平均值可以看出，A柱和B柱之间的相似度比较一致，且均高于C柱。结合特征色谱峰的峰形和相应的理论板数，可以初步确定A柱和B柱较C柱更适合黄芪药材HPLC-DAD指纹图谱的评价研究。

3 讨论

通过对黄芪药材HPLC-DAD指纹图谱的研究，可以确定色谱柱对指纹图谱获取的稳定性与重现性具有极其重要的作用。由于生产工艺的不同，即使填料相同的色谱柱也可能使相似度评价产生较大的差异。因此，采用HPLC-DAD指纹图谱技术进行中药质量控制与评价，有必要在指纹图谱研究中增加特征色谱峰的理论板数和分离度等系统适应性试验要求，使用于指纹图谱研究的色谱方法更加完整和严谨，保证方法的准确性和稳定性。

采用统计学分析的方法对不同色谱柱获取的HPLC-DAD指纹图谱相似度进行比较和评价，减少了主观判断可能出现的错误，这种方法的科学性还有待于进一步的探讨和分析。

本实验对黄芪药材HPLC-DAD指纹图谱在不同色谱柱间的相似度差异进行了考察和评价，进一步保证指纹图谱相似度计算结果的准确可靠，为黄芪药材HPLC-DAD指纹图谱的广泛应用提供依据，有利于相关研究的顺利开展。

［1］ 李阳革．黄芪对心血管保护的药理作用和临床应用进展［J］．中国实用医药，2009，4(7):149-150．

［2］ 张庆立．黄芪加丹参治疗小儿病毒性心肌炎临床观察［J］．华北国防医药，2002，14(2):139-140

［3］ 陈雅，余汶华．黄芪及其制剂的药理作用和临床应用进展［J］．中国药业，2006，15(3):68-69．

［4］ 李翔，王敏，王逢春．黄芪药材高效液相色谱－二极管阵列检测法指纹图谱最佳检测波长的选择［J］．华北国防医药，2010，22(5):424-426．

［5］ 王敏，潘书权，李翔，等．高效液相色谱－二极管阵列检测法指纹图谱和聚类分析用于黄芪质量评价［J］．华北国防医药，2010，22(3):219-221．

［6］ 王敏，李翔，王逢春．黄芪及相关药材HPLC-ELSD色谱指纹图谱研究［J］．华北国防医药，2010，22(1):32-34．

［7］ 田兰，程海燕，陈晓辉，等．黄芪药材的HPLC指纹图谱［J］．沈阳药科大学学报，2008，25(12):979-982．

［8］ 赖宇红，陈浩桉，区卓莹，等．三七总皂苷指纹图谱及含量测定HPLC条件的耐用性考察［J］．中国天然药物，2006，4(2):107-110．

［9］ 易伦朝，梁逸曾，谢培山，等．陈皮体系液相色谱柱兼容性考察［J］．现代中药研究与实践，2004，18(增刊):64-66．