苏豹，杨志雷，杨永红，*，刘君英，刘毅，管开云，韦建荣

(1.云南白药集团股份有限公司，云南 昆明 650118；2.云南农业大学 教育部农业生物多样性和病虫害防治重点实验室 云南省植物病理重点实验室 植物保护学院，云南 昆明 650201；3.中国科学院 昆明植物研究所，云南 昆明 650204)

植物粗提物杀灭滇重楼根茎线虫的研究△

苏豹1，杨志雷2，杨永红1，2*，刘君英2，刘毅2，管开云3，韦建荣1

(1.云南白药集团股份有限公司，云南 昆明 650118；2.云南农业大学 教育部农业生物多样性和病虫害防治重点实验室 云南省植物病理重点实验室 植物保护学院，云南 昆明 650201；3.中国科学院 昆明植物研究所，云南 昆明 650204)

目的：研究黄柏、雷公藤等16种植物粗提液对课题组分离、鉴定和培养的与滇重楼ParispolyphyllaSmith var.yunnansensis(Franch.)Hand.-Mazz.根茎腐烂有密切关系的主要害虫小杆线虫Rhabditissp.的毒杀作用。方法：各种植物汁液原液配成10倍、50倍、100倍、500倍的浓度梯度，用浸液法测试杀线效果。结果：药效试验显示16种植物粗提液均有毒杀效果；马缨丹花叶、万寿菊、杜鹃粗提液在72h后，对小杆线虫的致死率分别为71.4%～92.0%、83.7%～91.4%、73.3～89.0%。结论：植物杀线虫物质的成份和活性不仅与提取的植物种类、部位有关，也与植物新鲜度、粉碎度、提取时间、提取温度、提取液浓度及其作用线虫时间等因素也不同程度地影响着植物杀线虫物质的作用。

滇重楼；根茎腐烂；小杆线虫；植物粗提物

滇重楼ParispolyphyllaSmith var.yunnansensis(Franch.)Hand.-Mazz.是延龄草科(Trilliaceae)重楼属(Paris)植物，分布于云南、贵州和四川，生长在海拔1 400～3 100 m的常绿阔叶林、云南松林、竹林、灌丛或草坡中，根茎入药，有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊之功效，用于疔肿痈肿，咽喉肿痛，毒蛇咬伤，跌扑伤痛，惊风抽搐等症[1]。滇重楼作为中药材，其在我国有着悠久的药用历史，自古以来就有许多关于它的记载，是云南白药、宫血宁、夺命丹等一些重要中成药和新药的主要原料之一[2]。

由于近年来对滇重楼需求量逐年增加，野生药源远不能保障市场需要，加之乱采滥挖，忽视对滇重楼资源的保护和繁育，野生资源遭到严重破坏；另外，重楼药用部位根茎的自然生长十分缓慢，逐年的大量采挖已使野生重楼资源日趋枯竭。人工栽培是缓解滇重楼资源紧张的有效途径，但在人工栽培过程中发现，滇重楼根茎根极易遭受病虫害侵染，尤以根茎腐烂病最为严重。

目前，对滇重楼的人工繁殖技术已进行了大量的探索，主要集中在种子繁殖、组织培养、切块繁殖等方面，但对滇重楼根茎病害研究甚少，尤其是缺少滇重楼病虫害及其防治的相关研究。我们从滇重楼腐烂根茎中分离并鉴定得到小杆线虫(Rhabditissp.)、类符虫兆(FolsominaonychiurinaDenis)、罗宾根螨(RhizoglyphusrobiniClaparede)、吸螨(BdellaLatreille)和卡氏白线蚓(FridericiacarmichaeliStephenson)及土壤昆虫幼虫等[4～9]。本研究对我们分离、鉴定和培养的与滇重楼根茎腐烂有密切关系的主要害虫小杆线虫Rhabditissp.，用16种植物粗提液进行药效试验，为在人工繁殖过程中出现的根茎腐烂问题和病虫害的防治提供一定的依据和措施。

1 材料与方法

1.1 材料

小杆线虫Rhabditissp.：本实验室分离、鉴定和培养；

供试植物：选择一些对线虫有毒的植物，详见表1，由本课题组采集、鉴定。

1.2 方法[10]

用浸液法研究杀线效果，即将100头左右的线虫浸入一定浓度的药液中，每种药液设定5个浓度梯度，用无菌水作对照，每个处理重复3次。

冲洗干净采集的植物，晾去表面水滴，剪碎，匀浆，可加少量的无菌水，匀浆用三层滤布挤压过滤出植物液汁，各取15 mL放在三角瓶中封好，高压灭菌，取出用黑色塑料袋包好放在冰箱中保存。

实验步骤：

1)各种植物汁液原液配成10倍、50倍、100倍、500倍的浓度梯度，分装在小试管中，以无菌水作为对照。

2)用消毒液和无菌水冲洗线虫三次即可，线虫悬浮液浓度为200条/0.1 mL。

3)加入0.1 ml的线虫悬浮液到小试管中，4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h各观察一次，为计数方便，每次从试管中取摇匀的线虫悬浮液0.1 mL，计数活虫数和死虫数。

4)计算出死亡率和更正死亡率，判别线虫死亡方法为线虫呈僵直不动为死虫，呈弯曲蠕动状态的为活虫。死亡率和更正死亡率计算方法[11]。

5)采用Finney机率值分析法与最小二乘法计算毒力回归方程和LT50。数据组间经t检验检测显著性。实验数据通过软件EXCEL和DPS进行统计分析。

表1 供试植物

2 结果与分析

在测定药剂效果时，一般采用以不同剂量与相应的死亡率做成剂量—死亡率的毒力曲线，但该曲线是S形，不易精确求得LD50或LT50。所以将剂量换成对数值表示，将死亡用几率值表示，即可精确求出LD50或LT50。LD50或LT50最能反映药剂毒力的大小，是一个比较精确、稳定和可靠数值，该数值越小，效力越大。

由表2对各植物粗提液进行的毒力回归分析以及求得的LT50，即杀死50%线虫所需的时间，可以看出抑制线虫效果依次是：马缨丹花叶原液、万寿菊花原液、杜鹃花原液、马缨丹花10×、杜鹃花10×、三尖衫叶原液、三尖衫叶10×、万寿菊叶原液、万寿菊根原液、雷公藤叶原液、马缨丹花叶50×、万寿菊花10×、包菜叶汁原液、杜鹃花50×、细辛叶原液、烟叶原液、细辛叶10×、水飞蓟原液、曼佗罗叶原液、烟叶原液、夹竹桃叶原液、包菜叶汁500×、蓖麻枝叶原液、蓖麻枝叶100×。结果说明，除了植物杀线虫物质的成份和活性不仅与提取的植物种类、部位有关，也与植物新鲜度、粉碎度、提取时间、提取温度、提取液浓度及作用时间等因素有关。

目前，只研究了16种植物粗提液对线虫的毒杀效果，并未对其化学成分进行定性定量分析。因此，有待对其化学成分定性定量分析以及线虫毒杀机理进一步研究。

表2 线虫累计死亡率与时间的效应关系

续表

3 讨论

滇重楼是云南省地道稀缺名贵药材，是云南白药主要原料之一，随着中医药产业的快速发展，近年来云南省重楼的驯化栽培面积累计达40～66.67 hm2。其中，云南白药集团中药材优质种源为原料的生产企业用量大幅度增加，种植力度也在加大，据不完全统计，近10个繁育有限责任公司的重楼种植面积占重楼种植总面积的50%以上。人们对滇重楼栽培开展了大量研究，主要集中在种子繁殖、组织培养、切块繁殖等方面。首先，由于滇重楼种子有二次休眠的特性，打破休眠直至萌发需要较长时间，因此利用种子繁殖，技术复杂、生长周期长；组织培养繁殖方面，虽然许多科研机构已做了大量实验研究，如用滇重楼的茎、叶、花蕾等作外植体，目前仍极难诱导出愈伤组织，一直未有组培繁殖成功的报道；切块繁殖方面，近年取得一定进展。然而，切块繁殖的材料，其上根腐病发生非常严重，但研究报道甚少，因为滇重楼本身的生长习性和根茎构造等原因，滇重楼易发生根腐病，而滇重楼主要是以根茎入药，因此根腐病造成的损失就更为直接和严重，致使对根腐病的防治已成为滇重楼能否成功栽培的关键要素之一，化学防治不能从根本上解决问题，生物防治成为必然趋势，生物多样性、套种将成为可行之路。本研究对滇重楼进行田间调查发现，滇重楼的根腐病发病率一般为50%，严重者可达到87.7%，成为制约该原料内在质量和产量的关键因子之一。

3.1 害虫与病害严重程度的关系

本研究通过接种不同数量表面消毒的小杆线虫，以及从田间病根上分离的结果来看，虫口数量大，发病快，发病严重，虫口数量小，发病就较轻和发病速度慢。本研究还没有对线虫以外的其他可能病原物进行致病性测定，但接种小杆线虫显示出该线虫与根腐病存在密切关系。这种虫口密度大，发病重的原因可能是尽管线虫表面经过消毒处理，但不能排除线虫体内携带病原物的可能性，即消毒把线虫体外的潜在病原物杀死，但不能杀死虫体内的病原物，当线虫侵入重楼根茎时，病原物从线虫口腔排除从而侵染根茎。即小杆线虫可能是一种传播媒介。

3.2 线虫的防治

虽然目前还不能明确确定小杆线虫为病原线虫，但它接种的结果表明，它与重楼根腐病关系十分密切。因此，开展防治药剂筛选对控制根腐病亦有直接作用。近年来，利用植物天然活性物质防治植物寄生线虫是国外研究的热点，但就如何提高植物杀线虫物质的活性研究，国内鲜有资料报道。本试验进行了万寿菊、包菜、马缨丹、柏木、三尖衫等16种植物粗提液对线虫的毒杀效果测试，期望开发杀线剂新资源和人工合成高效低毒、无公害低残留物的杀线剂增添了新路径；另，根据化感效应采用，选择对其有毒杀作用的植物进行间作，预期会起到一定效果。

我们对滇重楼根腐病相关的生物因子进行了研究，根据结果，初步认为，造成的原因既有环境因素，也有生物因素。如根茎和土壤严格消毒后接种的植株在不适环境中仍出现此类病害，在接种消毒的小杆线虫试验时，不接种的空白对照在田间也发生类似根腐病。田间的光照条件对病害的严重程度也有一定的影响。本试验杀线效果最好的是马缨丹花叶原液、三尖衫叶原液和万寿菊花原液，72 h对线虫毒杀效果分别为92.0%、93.8%、91.4%。马缨丹的杀线效果很好，国内外对其杀线效果的研究较多，本试验也得到同样的效果。因此，作者提出以生物防治为主的综合防治措施，为下一步的田间防治试验提供科学根据。

本研究所用的植物粗提液有一定的毒杀线虫效果，重楼属于喜阴植物，可间植高秆作物和藤本作物遮荫。作者认为，将重楼与这些具有毒杀线虫的植物间作套种来防治病虫害可减轻根腐病的为害。因为天然植物挥发性物质或根分泌物和水浸出物对于已侵入寄主体内潜伏侵染的线虫，将会发挥其特有的渗透抑制效果，或者能诱发土壤线虫的天敌菌的旺盛生长，改变线虫的生境条件，控制线虫种群的增长率。关于这些植物源的粗提液活性测定问题，由于没有测定它们的有效成份，不能计算出它们的半致死浓度或剂量，故只采用了粗提液的不同稀释浓度，计算线虫半致死时间，这也是一种常见的计算方法。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010，183.

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TheVirulenceofVariousPlantWaterExtractsAgainstRhabditissp.fromRotRhizomeofParispolyphyllavar.yunnansensis

SU Bao1，YANG Zhi-lei2，YANG Yong-hong1，2*，LIU Jun-ying2，LIU Yi2，GUAN Kai-yun3，WEI Jian-rongi1

(1.YunnanBaiyaoGroupLimitedCompany，YunnanProvinceKunming650118，China；2.KeyLaboratoryforAgriculturalBiodiversityandPestManagementofChinaEducationMinistry；KeyLaboratoryforPhytopathologyinYunnanProvince；CollegeofPlantProtection，YunnanAgricultureUniversity；YunnanProvinceKunming650201，China；3.KunmingInstituteofBotany，theChineseAcademyofSciences，YunnanProvinceKunming650204，China)

Objective:To determine the poison effect of 16 kinds of plants water extracts which includePhellodendronamurense，Tripterygiumwilfondiiandetal，on main pestsRhabditissp.，which were isolated，identified and cultured fromParispolyphyllaSmith var.yunnansensis(Franch.)Hand.-Mazz.，related to the herb-Paris rhizome rot.Methods:The poison effect were tested with various plant water extract with concentrate 10 times，50 times and 100 times，500 times gradient，using the immersion method.Results:Efficacy trials showed 16 kinds of plant crude extract has the poison effect.There was distinctive difference among the nematicidal efficacy of various extracts of plants and parts.The water extracts ofLantanaindica，Tageteserecta，Rhododendronyunnanensehad the killing rates of 71.4%～92.0%，83.7%～91.4%，73.3～89.0% respectively in 72 h.Conclusion:Nematicides plant material composition and activity relates to the extraction of plant species and parts，freshness of plant，crushing ratio，extraction time，extraction temperature，the concentration of the extract and action time also affects the result of kill nematodes material in different degrees .

Parispolyphyllavar.yunnanensis； Rootstock rot； Nematode； Biological control

2013-05-07)

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国家工业和信息化部中药材扶持项目资助(2008年度)

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杨永红，E-mail：yyh831994@163.com