王 征 魁, 曹 体 爽, 刘 廷 强, 鱼 红 闪

( 大连工业大学 生物工程学院`, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

白头翁皂苷主要分为羽扇豆烷型与齐墩果烷型两类数十种皂苷及皂苷元[1]。研究者们发现皂苷有许多生理活性,如人参皂苷Rb1抗心脑血管系统疾病作用[2],白头翁皂苷的增强免疫、保肝抗炎、抗癌作用等[3]。

许多研究结果表明,天然苷类的分子结构并不是最佳活性状态,若有目的地水解掉皂苷上的糖基,使其转化为高活性次生皂苷,将会极大地提高其生理活性和应用价值[4]。杨宇等[5]成功地纯化了白头翁皂苷糖苷酶并研究了其酶学性质。本实验首先从药材白头翁中提取出白头翁总皂苷作为底物,并对其进行酶转化,将得到的产物和底物用硅胶柱层析法进行分离纯化,得到了较纯的底物和产物的纯品。

1 实 验

1.1 材料与仪器

白头翁,产地湖北；菌种Absidiasp.P00r,由大连工业大学生物工程学院菌种保藏所提供;硅胶,青岛海洋化工厂；薄层层析板(TLC),德国Merck公司；色谱仪,Waters2695高效液相色谱分析仪；TLC展开剂V(氯仿)∶V(甲醇) ∶V(水)=7∶3∶0.5。

1.2 方 法

1.2.1 硅胶柱分离纯化白头翁总皂苷

首先使用醇提法提取中药白头翁所含的总皂苷,再用硅胶柱对其进行分离纯化。

称取一定量的白头翁总皂苷,用适量甲醇溶解于3倍样品质量的80～100目硅胶,加热搅拌均匀至溶剂挥干。称取15倍样品质量300～400目硅胶,均匀倒入底部铺好脱脂棉的硅胶柱,再铺层80～100目缓冲胶,然后倒入样品胶。

皂苷的分离纯化:用一定量的纯氯仿通柱,按照V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5、9∶1、8.5∶1.5、8.3∶1.7依次进行洗脱。

1.2.2 酶转化白头翁总皂苷

按照m(麦麸)∶m(白头翁)=4∶1配制一定量固体培养基,在0.1 MPa、121 ℃条件下灭菌20 min,无菌室紫外线灭菌30 min。将菌种接入培养基,30 ℃条件下培养7 d,其间定时翻动培养基。培养结束后,培养基与缓冲液按体积比1∶5加入pH 5.0、0.02 mol/L 的NaAc-HAc缓冲液,浸泡2 h。分别经过纱布过滤、离心(均保留液相),加入3倍体积的95%乙醇,离心保留沉淀。沉淀用与培养基等体积的缓冲液溶解,即得酶液。

配制1 L 2%的底物溶液,与等量酶液混合后加入反应釜，40 ℃下反应90 h,95%乙醇溶液终止反应,上清液浓缩蒸干乙醇后加适量水溶解,用正丁醇将酶解产物萃取出来,蒸干待用。

1.2.3 硅胶柱分离纯化产物皂苷

用一定量的纯氯仿通柱,依次按V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5、9∶1、8.5∶1.5的洗脱比例进行洗脱,分别收集洗脱液。

1.2.4 HPLC法检测纯化后的底物和产物

色谱柱:Kromasil C18柱(5 μm,Φ4.6 mm×200 mm)。色谱条件:进样量，10 μL；柱温,35 ℃；体积流量,1.0 mL/min；检测波长,205 nm。流动相为乙腈(A)和水(B),进行梯度洗脱:0～10 min,φA=28%；10～15 min,φA=28%～32%；15～30 min,φA=32%～40%；30～45 min,φA=40%～100%。

2 结果与讨论

2.1 硅胶柱分离纯化白头翁总皂苷

白头翁经70%酒精浸泡、浓缩浸提液,再经AB-8大孔吸附树脂脱糖、D-296树脂脱色后,蒸干洗脱液即得白头翁总皂苷,分离纯化结果如图1所示。由图1可知,使用硅胶柱进行不同比例梯度洗脱,分离底物皂苷效果较好,组分A与组分B在V(氯仿)∶V(甲醇)=8.5∶1.5下依次洗脱出来；组分C与组分D则在V(氯仿)∶V(甲醇)=8.3∶1.7下洗脱出来,其得率分别达到了10.6%、13.8%、8.2%、15.3%。

图1 硅胶柱分离底物皂苷TLC图

Fig.1 Saponins substrate separated by silica gel column on TLC

2.2 硅胶柱分离纯化产物皂苷

称取反应后皂苷10 g,同样按照方法“1.2.1”制备硅胶柱,再依次按V(氯仿) ∶V(甲醇)=9.5∶0.5、9∶1、8.5∶1.5进行洗脱,未反应组分未收集，洗脱结果如图2所示。由图2可知,使用硅胶柱进行不同比例梯度洗脱,分离产物皂苷效果较好,在V(氯仿) ∶V(甲醇)=8.5∶1.5时,产物a、b、c均能被洗脱出来,得率分别达到了15.0%、7.1%、10.3%。

图2 硅胶柱分离产物皂苷TLC

Fig.2 Enzymatic products separated by silica gel column on TLC

2.3 HPLC检测底物及产物单品

称取少量底物、产物分离后的各组分,用甲醇溶解配制成1 mg/mL溶液,进行HPLC检测,结果如图3、4所示。由图3、4可知,底物纯度分别为83.94%、81.99%、80.18%、83.40%，产物纯度分别为93.45%、91.28%、100.00%。

(a) 底物A

(b) 底物B

(a) 产物A

3 结 论

菌种Absidiasp.P00r经诱导后产酶能良好地催化白头翁底物生成产物；使用硅胶柱层析法,洗脱梯度为V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5、9∶1、8.5∶1.5、8.3∶1.7，分离底物皂苷效果较好,得率分别为10.6%、13.8%、8.2%、15.3%,经过HPLC检验纯度分别为83.94%、81.99%、80.18%、83.40%；洗脱梯度为V(氯仿)∶V(甲醇)=9.5∶0.5、9∶1、8.5∶1.5，分离产物皂苷效果较好,得率分别为15.0%、7.10%、10.3%,经过HPLC检验纯度分别为93.45%、91.28%、100.00%，底物与产物均达到分离纯化的效果。

[1] 时维静,李立顺,董卫星. 白头翁化学成分、药理作用及临床应用研究进展[J]. 中兽医医药杂志, 2009(4):22-25.

[2] 贾继明,王宗权,吴立军,等. 人参皂苷Rb1的药理活性研究进展[J]. 中国中药杂志, 2008, 33(12):1371-1377.

[3] 路西明,王学廷,王建刚. 白头翁对小鼠免疫功能的影响[J]. 甘肃中医学院学报, 1998, 15(2):32-34.

[4] 刘琳,金凤燮. 白头翁皂苷的分离提纯[J]. 大连轻工业学院学报, 2004, 23(1):18-21.

(LIU Lin, JIN Feng-xie. Separation and purification of pulsatilla saponin[J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry, 2004, 23(1):18-21.)

[5] 杨宇,王东明,金凤燮,等. 白头翁皂苷糖苷酶的纯化及其酶学性质[J]. 大连工业大学学报, 2009, 28(6):404-407.

(YANG Yu, WANG Dong-ming, JIN Feng-xie, et al. Purification of pulchinenoside-glycosidase and its enzymatic characteristics[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2009, 28(6):404-407.)