曾婷婷，谢芝勋，谢丽基，刘加波，庞耀珊，范 晴，罗思思，邓显文，谢志勤

（广西壮族自治区兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁530001）

网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）不仅引起禽类发生肿瘤，雏禽感染后还能导致后期免疫抑制［1］。目前可以通过病毒分离物免疫荧光［2］、组织病理学、免疫组化、PCR［3］等方法进行诊断，但以上方法需要较长的周期或较昂贵的仪器才能完成。Notomi T等［4］建立的环介导等 温 扩 增 技 术 （loop－mediated isotheral amplification，LAMP）具有成本低廉、反应快速、操作简便和结果可视化等优点，目前已经广泛应用于畜禽传染病的 诊 断 中［5－7］。 本 试 验 参 考 Yang J等［8］的 方 法，先设计一套针对REV的LAMP引物，在此基础上加入一条加速引物，以期提高LMAP法检测REV的敏感性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒样品 网状内皮组织增生症病毒前病毒DNA、J亚群禽白血病病毒前病毒DNA、鸡马立克病病毒DNA、鸡传染性贫血病毒DNA、传染性法氏囊病病毒cDNA和禽呼肠病毒cDNA由本实验室保存；A亚群禽白血病病毒（RAV－1株）、B亚群禽白血病病毒（RAV－2株）购自中国兽医微生物菌种保藏中心。

1.1.2 试剂 Bst DNA 聚合酶（大片段）、MgSO4、甜菜碱为New England Biolabs公司产品；PCR试剂为北京全式金生物技术有限公司产品；海洋动物组织基因组抽提试剂盒为广州东盛生物科技有限公司产品；dNTPs为宝生物工程（大连）有限公司产品；钙黄绿素、MnCl2为International Laboratory USA产品。

1.2 方法

1.2.1 LAMP引物设计 根据GenBank中网状内皮组织增生症病毒gp90基因保守区段，使用在线软件Primer Explorer V4（http：／／primerexplorer.jp／e／v4－manual／index.html）设计 LAMP 引物。引物由广州Invitrogen公司合成。再在两条环引物中间设一条加速引物（accelerating primer，AP），用 Oligo 6.0验证与其他几条引物之间不能形成紧密的二聚体结构。……