柏 锡，刘 欣,3，翟 红，朱延明，才 华，纪 巍，罗 晓

（1.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2.中国科学院东北地理与农业生态研究所，哈尔滨 150081；3.黑龙江中科瑞合环保技术服务有限公司，哈尔滨 150090）

干旱、高盐、低温等不利环境条件对植物生长有极大危害，但是植物自身会对这些胁迫响应，从而对胁迫产生耐性。当胁迫来临时，与植物细胞膜表面的一些受体结合或者导致细胞膜的物理性质发生改变，通过转录因子引起下游基因对胁迫产生响应[1-2]。细胞膜是第一道生理屏障，通过对编码细胞膜相关基因的研究可进一步明确植物对胁迫的响应机制。

大量研究表明，膜蛋白广泛的参与到非生物胁迫的过程中。例如，AtHK1是拟南芥中编码非生物感受器的基因，AtHK1感知质膜表面的水势，通过对ABA合成的调节，在植株的种子萌发期和营养生长期对干旱产生耐性[3]。Qiu等研究表明SOS1是质膜Na+/H+逆向转运体，在高Na+条件下，SOS1使Na+流出木质部；在低浓度Na+条件下，SOS1只将Na+运送到木质部[4-5]。

At2g39530属于UPF0497（Uncharacteristic protein family 0497）家族成员，该家族包含有39个基因都编码膜蛋白。Daniele等研究表明，其中Clade II中5个成员与内皮层凯式带形成有关，casp1-1、casp3-1双突变后会改变凯式带结构[6]。对At2g39530的启动子进行启动子顺式元件分析，发现具有DRE顺式作用元件，DRE是在ABA-非依赖途径中调节下游基因表达的顺式作用元件[7-8]，因此At2g39530可能受该元件调控从而对非生物胁迫具有响应作用。

本研究通过Real-time PCR、亚细胞定位、组织定位分析等方法证明At2g39530的功能及其在非生物胁迫方面的作用，为研究UPF0497家族在非生物胁迫方面的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

拟南芥（Columbia）在含有0.8%琼脂的1/2 MS培养基上生长。水培法：拟南芥在不含有琼脂的1/2 MS培养液中生长。土壤中种植：在1∶1∶1混合的蛭石∶草炭∶营养土中生长，培养温度为22℃、光密度为 100 μmol·Photons·m-2·s-1、光周期为光照16 h；黑暗8 h。

1.2 生物信息学分析

利用Clustal W软件对UPF0497家族成员进行序列比对，用Maga 4.0软件中的邻接法进行进化树的构建[9-10]。在PlantCARE网站上进行启动子结构分析（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）。利用 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和 GENEVESTIGATOR（https://www.genevestigator.com/gv/）对At2g39530和At2g03700的芯片数据进行分析。

1.3 拟南芥在冷、干旱、盐和ABA胁迫下的表达特性分析

采用水培法，拟南芥在1/2 MS液体培养基中生长3周后对其进行胁迫处理，分别将拟南芥幼苗置于含有250 mmol·L-1NaCl，4℃，干旱和50 μmol·L-1ABA的液体1/2MS培养基中，干旱处理将幼苗称鲜重后放于平板内，开盖置于超净工作台中，使其失水。各种胁迫均含3次生物学重复，分别处理0、0.5、3、6 h后取材并且分别提取拟南芥地上和地下部分的RNA。RNA提取采用RNeasy plant mini-kit（TIANGEN）。采用SuperScript III反转录酶（Introvigen）及Oligo dT作为引物反转录出第一链cDNA。

Real-time PCR实验采用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）在 ABI 7 500 Real-time PCR仪上进行。反应体系及反应条件遵循说明书（SYBR Premix Ex Taq II）。试验采用actin2作为内参，actin2引物（At3g18780）：5'TTACCCGATGGGCAAGTC 3'和5'GCTCATACGGTCAGCGATAC 3'；At2g39530引物（At2g39530）：5'AATCGAACGGAGTTTGCG 3'和5'TACGGTGATGACGGTGGAG 3'。Real-time PCR数据处理采用 2-ΔΔCt的方法[11]。

1.4 组织定位分析

以野生型拟南芥（Col）DNA为模板，At2g39530启动子克隆的PCR引物：5'AATCTTCCCGTTAA TTAATCG 3'和5'CTTGTTTTCTCGAAAGAGTTTG 3'。以NcoⅠ和PstⅠ为酶切位点，将启动子插入到pCAMBIA3301载体上，通过花序侵染法转化拟南芥[12]。用50 μg·L-1的固沙草对种子进行筛选。通过GUS染色的方法对启动子进行不同生长时期的组织定位分析，方法如Jefferson等所述[13]。用70%乙醇在56℃条件下脱色，在Olympus实体显微镜下进行观察。

1.5 亚细胞定位分析

对At2g39530的亚细胞定位分析采用基因枪轰击洋葱表皮的方法。对At2g39530终止密码子突变，构建PBSK-At2g39530-eGFP的载体。At2g39530的克隆引物：5'GGAATTCCA TGGCTCCACC 3'和5'GCT CTAGAGCATGAGACTGGAACT 3'。以EcoRⅠ和XbaⅠ为酶切位点，将其构建到PBSK-eGFP的载体上。用质粒对洋葱表皮进行基因枪轰击，洋葱在1/2 MS培养基上暗处培养8～12 h，在共聚焦显微镜下进行观察。

2 结果与分析

2.1 UPF0497蛋白家族基因聚类和启动子序列分析

如图1所示，通过对UPF0497（Uncharacteristic protein family 0497）家族进行进化树分析，将其分为5个进化枝，与凯式带形成相关基因位于Clade I，分别为casp1-casp5。为了研究该家族成员在非生物胁迫中是否具有作用，对39个成员启动子进行启动子顺式元件分析，发现At2g39530和At2g03700的启动子具有DRE顺式作用元件，At2g39530属于Clade IV，At1g03700属于Clade II，其同源性不高。基因芯片数据表明At2g39530和At2g03700在胁迫下均有响应。本文选取At2g39530基因进行深入研究。

2.2 胁迫处理下的表达模式分析

为了研究At2g39530在非生物胁迫下的表达模式，采用Real-time PCR的方法研究At2g39530的地上和地下部分在盐、冷、干旱及ABA胁迫下的表达模式。

2.2.1 At2g39530在拟南芥地上部分的表达模式

拟南芥的地上部分在盐处理下，At2g39530在0.5 h有显著下调（P＜0.001）（见图2A），在3 h表达量倍数上调5倍，在6 h表达量与未处理时相比上调2倍。在冷处理下，At2g39530在3 h显著下调0.5倍（P＜0.05），在6 h表达量依然维持在下调的水平。结果表明At2g39530在拟南芥的地上部分对盐，冷处理均有一定响应，但是在干旱和ABA处理下表达量都没有显著差异。

图1 UPF0497家族成员的进化树构建Fig.1 Phylogenetic tree of the UPF0497 family

2.2.2 At2g39530在拟南芥地下部分的表达模式

At2g39530地下部分在干旱处理下3 h表达量上升2倍（见图2B），在6 h下调表达（P＜0.05）；在盐处理下，3 h表达量上升到3倍，在处理6 h后又回落到2倍，但表达量仍保持在较高水平。在冷处理下3 h表达量达到最高峰，相当于未处理时的3.5倍（P＜0.05）。在ABA处理下At2g39530表达量变化没有显著差异。说明At2g39530在干旱、盐、冷处理下表达量均有一定诱导表达，但是At2g39530在ABA处理下表达量没有显著变化。

图2 At2g39530在非生物胁迫下的表达水平分析及在地上部分和地下部分的表达量分析Fig.2 Evaluation of At2g39530 transcript levels under stress conditions and in shoot and root

通过对拟南芥在未处理时地上和地下部分的表达数据分析，表明At2g39530在拟南芥根中的表达量是地上部分的20倍（见图2C）。由于在地上部分仍然存在At2g39530的mRNA。说明At2g39530可能是根部增强性表达的基因。

2.3 At2g39530的组织定位分析

构建At2g39530的启动子融合GUS植物表达载体（见图3A，此图彩版见封三），转化拟南芥，对筛选得到的纯合体不同时期不同组织部位的GUS表达进行分析，结果表明GUS在根中表达量最高，进一步对根进行显微观察，发现GUS在根尖不表达，而在下胚轴的基部有少量表达（见图3B，此图彩版见封三）。Real-time PCR数据分析及组织定位分析都表明At2g39530属于根部增强性表达基因。

图3 At2g39530的组织定位分析Fig.3 Tissue localization analysis of At2g39530

2.4 At2g39530的亚细胞定位分析

克隆终止子突变的At2g39530全长序列并且将其插入到eGFP的上游，构建好亚细胞定位载体（见图4A，此图彩版见封三）。通过基因枪轰击洋葱的方法，在激光共聚焦显微镜下观察At2g39530的亚细胞定位信号。结果表明，PBSK-eGFP空载体呈现遍在表达；PBSK-At2g39530-eGFP在细胞的表达模式与对照相比，主要在细胞核和细胞质中表达（见图4B，此图彩版见封三）。说明At2g39530是一种在细胞核与细胞质中表达的蛋白。

图4 At2g39530的亚细胞定位分析Fig.4 Subcellular localization analysis of At2g39530

3 讨论与结论

非生物胁迫（盐、干旱、冷）都会严重威胁植物生长发育的各个方面，是造成农作物大规模减产的主要原因。因此，对非生物胁迫及植物耐逆机制的研究成为近年研究热点。UPF0497家族成员在非生物胁迫中的作用尚无研究。通过对家族成员启动子的顺式作用元件进行分析，发现只有At2g39530和At2g03700具有DRE顺式作用元件。通过对At2g39530和At2g03700的基因芯片数据进行分析，表明它们都对非生物胁迫具有响应作用，Li等通过生物信息学的方法表明At2g39530可能对非生物胁迫具有响应[14]。因此本试验选取At2g39530，研究UPF0497家族基因是否在非生物胁迫中具有作用。At2g39530不受ABA诱导，可能通过DRE元件以ABA非依赖方式对非生物胁迫产生响应。

UPF0497家族中5个成员与凯氏带形成有关。At2g39530属于根部增强性表达基因，但是根尖没有表达，由于凯氏带在远离根顶端位置的凯氏带发育的更早[15]，说明At2g39530可能与凯氏带的形成有关。大多数发育调控基因都表现出组织特异性表达的特性[16]，At2g39530在根中的作用仍需深入研究。

本研究证明At2g39530对干旱、低温和高盐具有响应作用，不响应ABA，该结果为研究UPF0497家族成员在非生物胁迫中的作用奠定基础。

At2g39530是一种根特异性表达并且在细胞核与细胞质中均表达的蛋白，可能通过DRE元件以ABA非依赖方式对非生物胁迫产生响应。初步阐明了UPF0497家族成员在对非生物胁迫也具有响应，但是非生物胁迫响应机制仍需深入研究。

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