宋 叶 涵，刘 富 俊，李 冬 梅，杨 静 峰，朱 蓓 薇

(1.大连工业大学 国家贝类加工技术研究分中心

(大连)，辽宁 大连 116034；2.辽宁省大连海洋渔业集团公司，辽宁 大连 116113)

0 引 言

硫酸基与多糖生物学活性有着密切关系，是否有硫酸取代、取代度及取代位置往往影响到多糖的生物活性有无和活性大小[1]。因此，确定硫酸多糖中硫酸基的取代位置是研究硫酸多糖构效关系的重要课题。

鲍鱼生殖腺多糖作为一种动物多糖，与植物多糖相比，与人体细胞有良好的生物兼容性，无细胞毒性且可被生物体分解，并且具有一定的抗氧化活性[2]、抗血栓及抗疲劳活性[3]、免疫活性增强和抗凝血[4]等生物学活性。但研究主要集中在对其生物活性的探讨，更深层次的研究如多糖结构、构效关系和作用机理还有待进行。

为达到脱除硫酸基以进行鲍鱼生殖腺多糖深层次研究的目的，作者考察了稀酸水解法[5]、一步脱硫法[6]和二步脱硫法[7]在鲍鱼生殖腺多糖脱除硫酸基作用中的应用效果，以期对今后海洋动物多糖脱硫酸化方法选择时有所借鉴。

1 实 验

1.1 仪器及试剂

皱纹盘鲍生殖腺，由大连獐子岛渔业集团股份有限公司提供，样品经冷冻干燥后粉碎待用。

二甲基亚砜、吡啶、草酸、三氧化锑、吡啶盐酸盐、甲醇、明胶、氯化钡等，均为分析纯。

LG－1.0型真空冷冻干燥机，沈阳航天新阳速冻设备制造有限公司；8050超滤搅拌器，Millipore France；T6系列紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 鲍鱼生殖腺粗多糖AGP的提取

依据本课题组前期建立的蛋白酶水解提取法提取鲍鱼生殖腺粗多糖(AGP)[8]。

1.3 硫酸根含量测定

采用氯化钡－明胶法进行检测[9]。

1.4 脱硫酸基方法

1.4.1 稀酸水解法

称取AGP 300mg放入具塞瓶中，加入0.1mol／L HCl 15mL，100℃加热分别水解1.5和2.5h，取出，冷却，立即用1mol／L NaOH 溶液进行中和至pH为7。中和液超滤除盐，冷冻干燥获得脱硫酸多糖DS－AGP1和DS－AGP2。

1.4.2 一步脱硫法

称取AGP 100mg放入具塞瓶中，加入二甲基亚砜9mL，120℃加热15min，使多糖全部溶解，冷却，加入吡啶500μL，草酸150mg，三氧化锑200mg，最后补充吡啶1mL，120℃反应3h，待反应液冷却后加入质量分数为6%的碳酸氢钠溶液5mL，摇匀后透析72h以上，冷冻干燥获得脱硫酸多糖DS－AGP3。

1.4.3 二步脱硫法

首先将鲍鱼生殖腺多糖由钠盐型转变为吡啶盐型：称取AGP 90mg溶解于6mL蒸馏水中，用0.1mol／L吡啶盐酸盐溶液透析24h，冷冻干燥即为鲍鱼生殖腺多糖吡啶盐。第二步溶剂离解脱硫酸基。延长加热时间可以提高硫酸基的解离程度，因此采用两种不同的处理，比较加热强度对鲍鱼生殖腺多糖硫酸基脱除的影响。处理一：将鲍鱼生殖腺多糖吡啶盐酸盐溶于10mL体积比V(二甲基亚砜)∶V(甲醇)∶V(吡啶)＝87∶10∶3的溶液中，80℃加热4h，冷却后，蒸馏水透析72h以上，冷冻干燥获得脱硫酸多糖DS－AGP4。处理二：同处理一，不同之处在于100℃加热6h，冷冻干燥获得脱硫酸多糖DS－AGP5。

2 结果与分析

2.1 稀酸水解法脱除硫酸基

稀酸水解法脱硫衍生物DS－AGP1和DSAGP2红外光谱见图1，其中1 253cm－1左右的吸收表明为S═ O伸缩振动，830cm－1左右的吸收为C—O—S的拉伸振动，证明DS－AGP1和DSAGP2均有SO2－4特征吸收峰，其余各峰的峰形和位置，仍与AGP类似，说明多糖分子的母体结构并未被破坏。将样品AGP、DS－AGP1和DSAGP2的红外吸收峰相比较可以看出，DS－AGP2的2个SO2－4的特征吸收峰强度较AGP明显减弱，但尚未达到良好的硫酸基脱除效果，推测可能是由于反应时间短，脱硫效果不明显。

图1 稀酸水解法脱硫样品的FTIR图谱Fig.1 The FTIR spectra of the desulfated sample of the hydrolysis by diluted acid method

2.2 一步脱硫法

在多糖AGP的红外光谱中，3 433和1 053cm－1附近有强吸收，示有—OH的O—H键伸缩振动和变角振动；2 937和1 412cm－1附近有吸收，分别示有C—H键的伸缩振动和变角振动，均表现为多糖的特征吸收峰。多糖在1 253cm－1的强吸收峰，证明有—OSO3—基团的S ═O伸缩振动，836cm－1处为—OSO3—基团的C—O—S伸缩振动。通过AGP与一步脱硫法脱硫衍生物DS－AGP3相比较，从红外光谱图2可以看出，第一，多糖的各特征吸收峰向低波数方向移动(以3 398、2 929和1 242cm－1处的特征吸收峰最明显)，可能是由于多糖羟基受到一步脱硫法反应条件或反应试剂的影响，使多糖的羟基形成氢键，引起羟基振动频率及S ═O键振动频率降低，从而波数变小。第二，脱硫后多糖在727cm－1出现了强吸收峰，表明产物中有(CH2)n基团。通过IR图谱分析可知，由于一步脱硫法采用120℃超高温处理条件，可能导致多糖分子的骨架结构受到严重破坏。

2.3 二步脱硫法

图2 一步脱硫法脱硫样品的FTIR图谱Fig.2 The FTIR spectra of the desulfated sample of the one－step desulfurization method

图3 二步脱硫法脱硫样品的FTIR图谱Fig.3 The FTIR spectra of the desulfated sample of the two－step desulfurization method

从红外光谱图3中可以看出，第一，AGP经过Chizhov A.O.法[7]处理后得到的脱硫衍生物DS－AGP5在1 253cm－1处S ═O键特征吸收峰消失，结合明胶比浊法[9]对其进行硫酸基含量测定，得到硫酸基脱除率为87.64%，说明脱硫比较彻底。但脱硫衍生物DS－AGP5在3 400、1 400～1 200和1 200～1 000cm－1附近的多糖类化合物的特征性吸收峰未发生改变，证明二步脱硫法未对多糖分子的母体结构造成破坏。第二，对比DS－AGP4和DS－AGP5的红外光谱图，可发现当提高加热温度并延长加热时间时，可显著提高其脱硫效果。因此，加热强度可能是影响脱硫度的另一个重要因素。

3 讨 论

稀酸水解法脱除硫酸基同一步脱硫法和二步脱硫法相比，脱硫效果不理想，并且反应是在高温下进行，能起到显著的降解作用，副反应明显，影响所得样品的性质。

一步脱硫法同其他方法相比，最突出的特点是实验操作简单，只需要一次反应即可，理论上可以最大限度地减少多糖样品在实验过程中的损失。但红外光谱图显示，曲线形状(吸收峰)与原样品相比发生较大变化，可能是由于该法采用超高温(120℃)处理条件，在脱除硫酸基的同时使多糖结构发生了明显变化，所以一步脱硫法并不是理想的鲍鱼生殖腺多糖的脱硫方法。

二步脱硫法因需要反复透析、冻干，所以需要的实验操作条件相对较为复杂，实验周期延长，并且多步骤操作可能会增加多糖样品损失，回收率较低。但是该法与其他方法相比，脱硫后的SO2－4吸收峰(1 253cm－1)强度显著降低，硫酸根的质量分数降到2.23%，硫酸根脱除率为87.64%，说明脱硫比较彻底，并且该法未对多糖分子的母体结构造成破坏，所以二步脱硫法是一种较为理想的鲍鱼生殖腺多糖的脱硫方法。

这些研究结果为进一步研究鲍鱼生殖腺多糖的构效关系提供了良好的研究基础。

[1]姚秋萍.硫酸多糖结构与性质的探讨[D].福州：福建农林大学，2006：17.

[2]李韬，周大勇，杨静峰，等.皱纹盘鲍性腺多糖抗氧化活性研究[J].水产科学，2009，28(4)：179－172.

[3]徐美玲，孙黎明，周大勇，等.皱纹盘鲍性腺多糖体外免疫活性和抗凝血活性的研究[J].水产科学，2009，28(9)：498－500.

[4]郭丽莉，朱蓓薇，孙黎明，等.鲍鱼性腺多糖抗血栓及抗疲劳活性的研究[J].大连工业大学学报，2011，30(4)：250－252.(GUO Li－li，ZHU Bei－wei，SUN Li－ming，et al.Antithrombotic and antifatigue activities of polysaccharide conjugates extracted from abalone gonad[J].Journal of Dalian Polytechnic University，2011，30(4)：250－252.)

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