黄 俊 黄江燕 吴钧芳 姜 红 万 欢 张明霞 (南昌大学第一附属医院心内科，江西 南昌 330006)

血管内皮的损伤是动脉增生性疾病和后续并发症的始动因素，内皮祖细胞(EPCs)能分化为成熟血管内皮细胞，在维持内皮功能稳定、促进血管修复方面有重要作用。高血压患者外周血中EPCs数量减少、功能受损，与血管内皮功能障碍密切相关。硝苯地平、塞利洛尔、洛沙坦等药物在降压治疗的同时，能增加患者外周血中EPCs数量，并改善其迁移、分化、抗氧化功能，从而改善血管内皮功能〔1，2〕。本文旨在研究血管紧张素转化酶抑制剂贝那普利对高血压患者外周血中EPCs功能的影响及初步机制。

1 材料与方法

1.1 患者入选 连续入选新诊断的1级原发性高血压患者58例，平均年龄(46±13)岁，男39例，女19例。诊断标准按《中国高血压防治指南2009年版》〔3〕，血压检测以24 h动态血压检测为准。排除标准:既往已服用过降压药物、合并血脂、血糖代谢异常、抽烟、酗酒、合并感染性疾病、高热、应用炎症抑制药物者。掷硬币法随机分为治疗组30例，平均年龄(46±11)岁，男21例，女9例，贝那普利10 mg/d(北京诺华公司)和对照组28例，平均年龄(45±14)岁，男20例，女8例，暂不行药物治疗，健康组30例为年龄、性别与研究组相匹配的健康体检者，研究时间4 w。分别于研究前后清晨空腹采血。

1.2 内皮祖细胞的培养、鉴定及功能检测

1.2.1 内皮祖细胞的采集、分离、培养、鉴定 每例患者取外周血15 ml，常规密度梯度离心法分离单个核细胞。以1×105/孔的密度接种在人纤维连接蛋白包被的6孔培养板，EGM-2-MV培养基及5%细胞来源患者血清于5%CO2培养箱中恒温培养，培养4 d，PBS洗掉非贴壁细胞。为维持细胞原生存环境，EGM-2-MV培养基加20%的细胞来源患者血清，继续培养至7 d后进行各种检查分析。贴壁细胞用Dil-acL、FITC-UEA-I行荧光化学染色，激光共聚焦显微镜下观察，双染色细胞被认为是正在分化的EPCs。每孔随机选择10个视野EPCs计数，取其平均值换算细胞浓度。实验分为健康组、对照组、贝那普利治疗组。

1.2.2 贝那普利治疗前后对EPCs增殖能力的影响 96孔培养板每孔接种5×103个EPCs，培养24 h待其贴壁后，以PBS洗涤2次，再用含1%细胞来源患者血清的EGM-2-MV培养基继续培养12 h后开始实验，用含20%患者血清的培养液培养24 h，每孔加入MTT至终浓度为500 mg/L，继续培养5 h弃培养液，加入 DMSO 150 μl，振荡使结晶溶解后酶标仪读取A490 nm值。

1.2.3 贝那普利治疗前后对EPCs迁移能力的影响 用含1%细胞来源患者血清的EGM-2-MV培养基培养12 h后开始实验。将含20%患者血清培养液30 μl注入改良的Boyden下室，将含3×104个EPCs的培养液50 μl注入上室，刮去滤膜上面的未移动细胞甲醇固定，Giemsa染色，随机选择5个显微镜视野(×200)计数迁移到下室的细胞。

1.2.4 贝那普利治疗前后对EPCs黏附能力的影响 用含20 mg/L人纤维连接蛋白的 PBS包被 96孔板，50 μl/well，4℃过夜备用。用含1%细胞来源患者血清的EGM-2-MV培养基继续培养12 h后开始实验。用含20%患者血清的培养液培养24 h，调细胞浓度为1×108/L，100 μl/well加入包被好的96孔板中。37℃、5%CO2下黏附45 min，PBS洗去未黏附的细胞。每孔加入CCK-8溶液10 μl，4 h后比较各组吸光度值。

1.3 贝那普利治疗前后，EPCs氧化应激检测 用1%细胞来源患者血清的EGM-2-MV培养基继续培养12 h后开始实验。用含20%患者血清的培养液培养24 h，黄嘌呤氧化法测定上清液中超氧化物歧化酶(SOD)活力，硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量。按照试剂盒说明书操作，分光光度仪(日本Hitachi公司)测取各组的吸光度OD值，计算各组的SOD活性、MDA含量。

1.4 超声检测血管内皮功能 参照Celermajer等〔4〕方法，受试者仰卧位休息10 min，左臂肘关节上方2～10 cm处探查肱动脉长轴切面，心室舒张期末测量肱动脉前后内膜之间的距离，即基础肱动脉内径。然后行反应性充血试验，血压计袖带将前臂加压至300 mmHg持续5 min，然后迅速放气，1 min内再次记录及测量肱动脉内径。测试过程中探头始终处于固定位置，每次测量肱动脉内径均取同一部位。血流介导的血管扩张(FMD)=(充血后肱动脉内径-基础状态肱动脉内径)/基础状态肱动脉内径×100%。

1.5 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件对数据进行统计学分析，数据以±s表示，多组均数间比较进行方差齐性检验和单因素方差分析。

2 结果

2.1 贝那普利治疗前后患者血压、心率、血管内皮依赖性扩张反应变化 高血压患者经贝那普利10 mg/d治疗4 w，其收缩压、舒张压与治疗前比较均明显降低(P＜0.05)，而贝那普利治疗前的血压与对照组比较无显著差异。心率各组之间均无统计学差异。血流介导的肱动脉血管扩张FMD值贝那普利组治疗前与对照组比较无显著差异，而贝那普利治疗后与治疗前比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 入选各组患者经贝那普利治疗前后的血压、心率、血管内皮依赖性扩张反应变化(±s)

与治疗前比较:1)P＜0.05，下表同

组别 n 收缩压(mmHg)舒张压(mmHg)心率(次/min)动脉内径(mm)FMD(%)健康组30 116±16 68±11 68±21 3.72±0.61 16.7±7.2对照组 28 142±19 91±11 64±18 3.76±0.68 6.6±4.3贝那普利治疗前 30 143±18 92±9 66±19 3.78±0.69 6.8±4.4贝那普利治疗后 30 121±141)72±111) 67±16 3.81±0.72 12.2±5.21)

2.2 贝那普利治疗前后患者外周血EPCs增殖、迁移、黏附能力变化 入选患者经贝那普利10 mg/d治疗4 w前后分别采外周血分离培养EPCs检测。对照组与贝那普利治疗前患者比较，其EPCs的增殖、迁移、黏附能力无明显差异，而贝那普利治疗后与治疗前比较，EPCs的增殖、迁移、黏附能力明显改善(P＜0.05)。见表2。

表2 入选各组患者贝那普利治疗前后EPCs的增殖、迁移、黏附能力(±s)

表2 入选各组患者贝那普利治疗前后EPCs的增殖、迁移、黏附能力(±s)

组别 n 增殖(A490 nm)迁移细胞(×102)黏附细胞(×102)健康组30 0.523±0.068 13.8±2.9 38.1±5.3对照组 28 0.245±0.032 7.2±1.1 19.6±2.4贝那普利治疗前 30 0.238±0.033 7.4±1.2 18.9±2.5贝那普利治疗后 30 0.495±0.0581) 12.6±2.31) 32.8±4.91)

2.3 贝那普利治疗前后患者外周血EPCs中SOD、MDA变化入选患者经贝那普利10 mg/d治疗4 w前后分别采外周血分离培养EPCs检测SOD、MDA水平。对照组与贝那普利治疗前患者比较EPCs中SOD活性、MDA含量无明显差异，而贝那普利治疗后与治疗前比较，EPCs中的SOD活性、MDA含量明显改善(P＜0.05)。见表3。

表3 入选各组患者贝那普利治疗前后EPCs的SOD、MDA检测(±s)

表3 入选各组患者贝那普利治疗前后EPCs的SOD、MDA检测(±s)

组别 n SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)健康组30 75.54±8.96 9.36±1.64对照组 28 40.63±9.87 16.15±2.43贝那普利治疗前 30 41.26±10.15 15.87±2.71贝那普利治疗后 30 69.89±10.541) 10.21±1.781)

3 讨论

血管内皮细胞的损伤既是心、脑、肾等器官病变及各种血管病变的始动因素，也是许多心脑血管疾病危险因子作用的靶器官。Asahara等〔5〕首次报道外周血中可分离出EPCs，EPCs能增殖分化为成熟血管内皮细胞，参与出生后的血管新生、血管形成及内皮损伤修复，在保护中发挥一定作用。

由于外周血中EPCs独特的血管内皮细胞修复功能，高血压患者外周血中EPCs的功能研究日益受到关注。Oliveras等〔6〕研究证实难治性高血压患者外周血中EPCs的数量明显减少，同时内皮依赖性血管扩张反应受损。Sugiura等〔1〕用nifedipine治疗高血压患者4 w，发现患者内皮依赖性血管扩张反应改善，外周血中EPCs数量增加，体外培养的EPCs迁移、分化、抗氧化功能增强。高血压的发病机制中肾素-血管紧张素系统起重要作用，血管紧张素转化酶抑制剂贝那普利在降低血压的同时，改善血管、心脏重构，改善血管内皮细胞功能。本研究进一步证实贝那普利能改善1级高血压患者外周血中EPCs的增殖、迁移、黏附能力，从而增加修复受损血管内皮细胞的能力，改善患者血管内皮功能。

机体正常情况下活性氧产生和抗氧化酶保持一个动态平衡状态，脂质过氧化物MDA的醛基可与血管内皮细胞生物膜磷脂中的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的氨基组分发生交联聚合反应，导致内皮细胞退行性变化和通透性改变。抗氧化酶SOD可抑制氧化应激反应，在维持体内氧自由基的动态平衡方面有重要意义。高血压患者EPCs功能受损与氧化应激有密切关系，抗氧化剂塞利洛尔治疗高盐饮食自发性高血压大鼠2 w，EPCs数量、体外迁移黏附能力明显提高，EPCs衰老减少，氧化应激产物减少〔7〕。ARB类药物洛沙坦改善自发性高血压大鼠的EPCs功能与其抗氧化应激有关〔2〕，替米沙坦通过调节高糖环境下血管内皮细胞的氧化应激反应来保护内皮细胞功能〔8〕。对血管内皮细胞的保护由本观察也可以看出，贝那普利在降压的同时也改善了1级高血压患者外周血中EPCs氧化应激反应。血管内皮功能障碍的临床客观证据是内皮依赖性舒张功能下降，高分辨超声能显示肱动脉的清晰图像，是无创检测血管内皮依赖性舒张功能简单而可靠的方法。本研究证实贝那普利治疗4 w明显改善了1级高血压患者的血管内皮舒张功能。

综上，1级高血压患者采用贝那普利治疗4 w能明显降低血压，改善患者的血管内皮功能。而这些作用除与阻断肾素-血管紧张素系统机制外，对患者外周血中EPCs功能的改善、氧化应激反应的抑制也有一定的关系。

1 Sugiura T，Kondo T，Kureishi-Bando Y，et al.Nifedipine improves endothelial function:role of endothelial progenitor cells〔J〕.Hypertension，2008;52(3):491-8.

2 Yao EH，Fukuda N，Matsumoto T，et al.Losartan improves the impaired function of endothelial progenitor cells in hypertension via an antioxidant effec〔tJ〕.Hypertens Res，2007;30(11):1119-28.

3 刘力生，王 文，姚崇华.中国高血压防治指南(2009年基层版)〔J〕.中华高血压杂志，2010;18(1):11-30.

4 Celermajer DS，Soreasen KE，Gooch V，et al.Non-invasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of atherosclerosis〔J〕.Lancet，1992;340(8828):1111-5.

5 Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis〔J〕.Science，1997;275(5320):964-7.

6 Oliveras A，de la Sierra A，Martínez-Estrada OM，et al.Putative endothelial progenitor cells are associated with flow-mediated dilation in refractory hypertensives〔J〕.Blood Press，2008;17(5-6):298-305.

7 Yao EH，Fukuda N，Matsumoto T，et al.Effects of the antioxidative betablocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats〔J〕.Am J Hypertens，2008;21(9):1062-8.

8 黄 俊，肖 静，赫连蔓，等.替米沙坦对高糖环境下人血管内皮细胞的保护作用及机制的研究〔J〕.中华高血压杂志，2008;16(4):314-6.