范鸣玥郭艳苏张维娜李玲董艳红崔文柱吕佩源

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是由各种脑血管疾病（包括缺血性脑血管病、出血性脑血管病）导致的获得性、持续性智能障碍综合征。脑缺血再灌注能导致啮齿类模型动物细胞凋亡，并引起认知功能障碍。糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）是一种丝氨酸—苏氨酸蛋白激酶，在脑缺血缺氧损伤中发挥促凋亡作用，同时其与阿尔茨海默病中Aβ抑制海马长时程增强[1]及Tau蛋白的异常磷酸化[2]有关，但有关其在VD中作用的报道甚少。本研究通过观察反复脑缺血再灌注后较长时间内海马组织GSK3β及p-GSK3β Ser9的表达情况，探讨GSK3β在VD发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 研究动物 8周龄健康雄性C57Bl/6小鼠（C57小鼠）96只，体重22～25g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：0202165。实验前小鼠适应性饲养一周，饲养室室温22～24℃，相对湿度50%～60%，12h明暗交替光照。实验前，将小鼠置于水迷宫内自由游泳30s，排除有游泳障碍的动物。采用随机数字表法将小鼠分为模型组、假手术组，再依术后不同时间分为2周、4周、6周3个亚组，每亚组16只。术后模型组小鼠共死亡8只，其中术后2周、4周、6周各死亡3只、2只、3只。

1.2 模型制备 手术操作参照文献[3]进行，小鼠腹腔注射10%水合氯醛（350mg/kg）麻醉后，仰卧位固定，颈部消毒，正中切口，于颈动脉鞘内钝性分离双侧颈总动脉，并以“4”号丝线同时结扎阻断双侧血流20min，松开丝线恢复血流10min，然后再次阻断血流20min，恢复血流10min，如此重复3次。第3次血流再灌注后观察30min，如小鼠呼吸、心跳平稳即缝合皮肤，放回笼中正常饲养。假手术组步骤同上，仅分离双侧颈总动脉，套丝线，但不阻断血流。

1.3 学习、记忆能力测试

1.3.1 水迷宫实验 采用小鼠水迷宫实验装置（中国医学科学院药物研究所）测试。记录术后第15 d、29 d、43 d小鼠游完全程时间作为学习成绩。术后第16 d、30 d、44 d，再次测试上述指标作为记忆成绩。

1.3.2 跳台实验 采用小鼠跳台装置（中国医学科学院药物研究所）测试。记录术后第15 d、29 d、43 d小鼠遭受电击后首次找到安全台的反应时间作为学习成绩。术后第16 d、30 d、44 d将小鼠直接放在安全台上，同时给铜栅通电，记录小鼠第一次从安全台跳到铜栅上的潜伏时间作为记忆成绩。

1.4 HE染色观察海马组织病理学变化 术后第16 d、30 d、44 d，行为学测试完毕后，相应亚组各取6只小鼠，灌注后取脑组织制备石蜡组织标本，冠状切片，厚度5μm。经HE染色后，在10×40倍光镜下观察海马CA1区。

1.5 检测海马组织中GSK3β及p-GSK3β Ser9蛋白表达情况 术后第16 d、30 d、44 d，行为学测试完毕后，相应亚组取6只小鼠，冰上取脑组织并分离出海马，用细胞裂解液（碧云天生物技术研究所）抽提海马组织总蛋白进行10%SDS-PAGE蛋白电泳，4℃环境中100V恒压转膜1.5h，5%脱脂奶粉室温封闭PVDF膜0.5h；0.01mol/L PBS稀释一抗（鼠抗β-actin，美国Santa Cruz公司，1：1000稀释；兔 抗 GSK3β、p-GSK3βSer9，美 国 Cell Signaling Technology公司，均为1∶1000稀释），4℃孵育过夜。抗兔或抗鼠荧光二抗（Rockland公司，1：5000稀释）反应1h，Odyssey双色红外荧光成像系统进行图像分析。以β-actin作为内参。

1.6 统计学方法 运用SPSS 17.0进行统计分析。所有指标以均数±标准差（±s）描述，各组动物之间行为学测试结果及蛋白表达情况的分析采用两因素（处理因素与时间因素）析因设计资料的方差分析，进一步两两比较采用SNK法。检验水准α为0.05。

2 结果

2.1 学习、记忆能力测试

2.1.1 水迷宫实验各组小鼠学习阶段游完全程时间经析因分析示，处理主效应（F=50.949，P＜0.001）和时间主效应（F=5.188，P=0.008）均有统计学意义，但2者交互效应无统计学意义（F=2.143，P=0.124）；经 SNK 法比较，以术后 4周时间最长（P＜0.05）。各组小鼠记忆阶段游完全程时间经析因分析示，处理主效应（F=44.417，P＜0.001）、时间主效应（F=5.507，P=0.006）及 2者交互效应（F=3.606，P=0.032）均有统计学意义；经SNK 法比较，以术后4周时间最长（P＜0.05）。见表1。

表1 术后2、4、6周各组小鼠水迷宫、跳台实验结果（±s）

表1 术后2、4、6周各组小鼠水迷宫、跳台实验结果（±s）

1）与假手术组同时间点比较，经SNK检验，P＜0.05；2）与同组其它时间点比较，经SNK检验，P＜0.05

组别模型组2周4周6周假手术组2周4周6周n 水迷宫实验学习阶段游完全程时间（s） 记忆阶段游完全程时间（s）跳台实验学习阶段反应时间（s） 记忆阶段潜伏时间（s）13 14 13 67.85±36.151)110.00±25.721)2)80.00±44.631)63.85±24.251)108.93±23.871)2)67.38±38.901)88.69±71.511)128.93±96.251)68.69±43.831)85.23±72.701)50.07±10.391)67.92±29.541)16 16 16 36.44±17.50 43.69±40.612)29.75±22.89 29.00±20.54 36.75±42.222)36.00±36.51 19.94±7.41 24.50±9.37 23.56±8.67 191.63±111.64 140.19±68.97 142.00±59.74

2.1.2 跳台实验各组小鼠学习阶段反应时间经析因分析示，处理主效应（F=45.492，P＜0.001）有统计学意义，时间主效应（F=2.905，P=0.060）和2者交互效应（F=2.576，P=0.082）无统计学意义。各组小鼠记忆阶段潜伏时间的处理主效应（F=37.572，P＜0.001）和时间主效应（F=3.170，P=0.047）均有统计学意义，但2者交互效应无统计学意义（F=0.397，P=0.674）。见表1。

2.2 海马组织HE染色 模型组海马CA1区锥体细胞数目减少，排列松散、紊乱，细胞核体积变小、深染，呈核固缩表现，核仁消失，细胞质呈强嗜酸性，见图1 A1、A2、A3。术后4周仅有少量细胞形态正常。

假手术组海马CA1区锥体细胞数目多，排列紧密、均匀，轮廓清楚，边界整齐，细胞核大而圆，核仁清晰，染色质丰富，胞浆清亮，见图1 B1、B2、B3。

2.3 海马组织GSK3β、p-GSK3β Ser9蛋白的表达各组小鼠GSK3β总蛋白表达的处理主效应（F＜0.001，P=1.000）、时间主效应（F=0.002，P=0.998）及2者交互效应（F=0.012，P=0.988）均无统计学意义，见表2和图2。各组小鼠p-GSK3β总蛋白表达的，处理主效应（F=58.036，P＜0.001）和时间主效应（F=20.076，P＜0.001）均有统计学意义，2者交互效应亦有统计学意义（F=20.470，P＜0.001）；经SNK法比较，以术后4周表达最高（P＜0.05），见表2和图2。

图1 A1、A2、A3分别为模型组术后2周、4周、6周海马组织形态（HE染色，10×40）；B1、B2、B3分别为假手术组术后2周、4周、6周海马组织形态（HE染色，10×40）

图2 术后2、4、6周各组小鼠GSK3β、p-GSK3β蛋白表达情况（1：假手术组，2：模型组）

表2 术后2、4、6周各组小鼠GSK3β蛋白、p-GSK3βSer9蛋白表达情况（±s）

表2 术后2、4、6周各组小鼠GSK3β蛋白、p-GSK3βSer9蛋白表达情况（±s）

1)与假手术组比较，经SNK检验，P＜0.05；2)与其它时间点比较，经SNK检验，P＜0.05

6周0.87±1.05 0.80±0.85组别模型组假手术组n 6 6 GSK3β/β-actin p-GSK3βSer9/β-actin 2周0.83±0.94 0.86±0.98 4周0.84±1.03 0.88±1.06 2周0.42±0.081)0.20±0.06 4周0.76±0.211)2)0.20±0.082）6周0.22±0.061)0.20±0.06

3 讨论

短暂性脑缺血能引起选择性神经元坏死、细胞凋亡、静止性梗塞，反复发生时可引起认知下降[4]，与学习记忆功能关系密切的海马神经元对缺血损害非常敏感[5]。

目前使用较多的4血管阻断（4-vessel occlusion，4-VO）法建立的大鼠反复缺血再灌注和慢性低灌流模型虽可引起不可逆的学习记忆损害，但操作较困难，动物死亡率较高。同时由于基因敲除和转基因技术的限制，大鼠暂不适宜用于基因研究，从而给分子机制的研究和治疗带来限制。本实验采用雄性C57小鼠反复结扎双侧颈总动脉的方法造成动物脑组织反复缺血再灌注，因其先天性后交通动脉不发达，不能及时代偿前脑缺血，故在较长时间内保持低灌注状态[6]，与临床VD的发病类似。另外，此法手术操作简单、动物死亡率低。行为学测试结果也显示术后小鼠出现持续的学习记忆能力障碍，经HE染色证实海马组织出现显著病理学改变，均证明此模型是较理想的VD模型。

GSK3是一种丝氨酸—苏氨酸蛋白激酶[7]，广泛表达于真核生物中。它有α（51kDa）和β（46kDa）2种亚型，GSK3β在神经系统中较丰富，p-GSK3β Ser9是其失活形式。最近研究发现，GSK3β能通过多条途径促进细胞凋亡，但其在VD中是否起重要作用尚未明了。本实验中，各时间点GSK3β蛋白的表达变化在2处理组间未见统计学差异，提示其可能不是参与反复缺血再灌注的形式，而p-GSK3β Ser9在较长时间内表达持续增高，提示反复脑缺血再灌注损伤能在较长时间内通过磷酸化形式抑制GSK3β的活性，可能是机体自身抵抗缺血再灌注损害、发挥神经保护作用的机制之一。究其原因可能是脑缺血再灌注刺激可以激活细胞存活/凋亡相关的PI3K/Akt信号通路[8]，活化的Akt与GSK3β结合后，磷酸化其N端的Ser活性位点而使GSK3β失活，从而阻止凋亡发生[9]。

最近研究发现，GSK3β与学习记忆关系密切。氯化锂可能通过增加p-GSK3β表达，改善脆性X综合征基因敲除小鼠学习记忆能力[10]。本次实验中，p-GSK3β Ser9表达持续增高的同时，观察到小鼠出现持续的学习记忆功能障碍，与上述研究结果不一致。推测原因可能是反复缺血再灌注刺激引起的p-GSK3β Ser9表达增加只能在一定时间、一定程度上发挥保护作用，并不能完全阻止行为学受损的发展，小鼠的持续性认知功能异常可能是多种机制共同参与的结果。p-GSK3β与认知障碍之间的关系仍需进一步的实验验证，而以p-GSK3β为靶点的进一步研究有可能为VD的防治提供新的途径。

[1]Jo J,Whitcomb DJ,Olsen KM,et al.Aβ(1-42)inhibition of LTP is mediated by a signaling pathway involving caspase-3,Akt1 and GSK-3β[J].Nat Neurosci,2011,14(5):545-547.

[2]Zhao HH,Di J,Liu WS,et al.Involvement of GSK3 and PP2A in ginsenoside Rb1's attenuation of aluminum-induced tau hyperphosphorylation[J].Behav Brain Res,2013,241:228-234.

[3]宋萍萍,王东信,王沛钰.利多卡因对不同载脂蛋白E基因型小鼠短暂全脑缺血后脑损害程度的影响[J].中华医学杂志,2005,85(48):3401-3408.

[4]Unal I,Gursoy-Ozdemir Y,Bolay H,et al.Chronic daily administration of selegiline and EGb 761 increases brain's resistance to ischemia in mice[J].Brain Res,2001,917(2):174-181.

[5]Hodges H,Nelson A,Virley D,et al.Cognitive deficits induced by global cerebral ischaemia:prospects for transplant therapy[J].Pharmacol Biochem Behav,1997,56(4):763-780.

[6]Shibata M,Ohtani R,Ihara M,et al.White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion[J].Stroke,2004,35(11):2598-2603.

[7]Parker PJ,Caudwell FB,Cohen P.Glycogen synthase from rabbit skeletal muscle;effect of insulin on the state of phosphorylation of the seven phosphoserine residues in vivo[J].Eur J Biochem,1983,130(1):227-234.

[8]Zhu YM,Wang CC,Chen L,et al.Both PI3K/Akt and ERK1/2 pathways participate in the protection by dexmedetomidine against transient focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats[J].Brain Res,2013,1494:1-8.

[9]Ambacher KK,Pitzul KB,Karajgikar M,et al.The JNK-and AKT/GSK3β-signaling pathways converge to regulate Puma induction and neuronal apoptosis induced by trophic factor deprivation[J].PLos One,2012,7(10):e46885.

[10]陈盛强,罗学港,杨泉.GSK3抑制剂氯化锂对脆性X综合征模型小鼠避暗行为的干预作用[J].中国神经精神疾病杂志,2012,38(8):486-489.