李天明 朱灵桓 刘天佳 戴宝新 冯惠勇

氧化还原酶是催化制备羟基酸、手性醇、氨基酸等的一类重要的酶类。而在氧化还原酶所催化的反应中，约80％的反应需要尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，NADH）作为辅酶，一定量的辅酶会随着合成产物的生成而消耗，因此氧化还原酶在应用中特别需要高效、低成本的辅酶再生系统［1］。

甲酸脱氢酶（Formate Dehydrogenase，FDH，EC1.2.1.2）是氧化还原酶辅酶NAD+和NADH再生循环体系中的关键酶，它可以将甲酸氧化为CO2，同时将NAD+还原为NADH［2］。甲酸/甲酸脱氢酶作为NADH再生系统，其优势在于反应不可逆，甲酸价格低廉且很多酶对此有很高的耐受性；此反应只产生一种副产物CO2，对任何酶的活性均没有任何影响，而且很容易从反应体系中释放出来，有利于产物的分离、纯化［3］。在需要辅酶NADH再生的反应中，甲酸脱氢酶具有重要的应用价值和产业化应用前景。德国Degussa公司利用博伊丁假丝酵母（Candida boidinii）FDH再生NADH生产ter-L-亮氨酸，是成功利用酶法生产医药产品的典型例子之一［4］。

人工合成DNA是合成生物学研究的基础，利用重叠延伸PCR（gene splicing by overlap extension，SOE PCR）技术合成所需要的目的基因序列，在多个领域广泛应用［5］。本研究采用利用重叠延伸PCR，根据Pseudomonas sp.101来源的甲酸脱氢酶氨基酸序列［6］，成功合成了具有大肠杆菌碱基偏好性的FDH编码基因，并在E.coli BL21（DE3）中得到高效表达；为提高FDH的稳定性，采用融合PCR方法对FDH基因进行了饱和定点突变，旨在为FDH的广泛应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒 试验中需用的大肠杆菌E.coli DH5α，E.coli BL21（DE3）和pET-30a均为实验室保藏。

1.1.2 主要试剂……