杨 倩 谢艳华周暄宣 朱爱华 同卓斌 胡少婷 王四旺

1.第四军医大学药学院天然药物学教研室，陕西西安， 710032；2.陕西医药控股集团公司陕西中药研究所，陕西西安 710082

衰老是正常的生理现象，亦是自然规律。抗衰老一直是医学界普遍关注的科学问题，但因衰老机制不明，防治衰老的药物实无根本突破。英国学者Hatman 曾于1956年提出衰老的自由基学说，认为人体内存在清除自由基的防御系统，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物（GSH-Px）及维生素、氨基酸、金属蛋白等；随着年龄的增长，机体抗氧化防御物质合成和活性下降，清除自由基能力降低，导致自由基代谢产物丙二醛（MDA）等大量堆积，加速机体的衰老[1-2]。中医认为，衰老与肾虚、肾精不足密切相关，补肾中药是中药延缓衰老的有效药物。佳蓉片是我科室20 世纪90年代研制成功的主治更年期综合征新药（国药证字Z20026690），经多年临床应用证实，不仅对更年期综合征具有明显疗效，而且发现能够显著改善衰老证侯，如减少面部皱纹、延缓绝经期、促进生育能力[3-5]。为什么佳蓉片会有如此功效呢？经检索和分析处方中倒卵叶五加可能具有抗衰老作用。为证实该推论，本研究设计了倒卵叶五加的抗衰老作用实验研究，以期探讨倒卵叶五加和佳蓉片对亚急性衰老大鼠血清MDA 含量，GSH-Px 和SOD活性、总抗氧化能力（T-AOC）、以及睾丸组织中NO、iNOS含量的影响；评价倒卵叶五加及其复方的抗衰老作用。

1 材料与方法

1.1 试剂

D-半乳糖，批号201112B09，北京化学试剂公司，采用生理盐水配成 6%的溶 液；SOD、MDA、GSH-P、T-AOC、NO、iNOS 试剂盒，南京建成生物工程研究所。倒卵叶五加浸膏，含生药量3.8 g/g 浸膏，批号2011091201，由宝鸡饮片出品；佳蓉片，批号201111032，陕西博爱制药有限公司出品。

1.2 实验动物

SD 大鼠，8周龄，雄性 60只，体重 200～250 g[由第四军医大学实验动物研究中心提供，动物合格证号：SCXK（军）字第2007-007 号]。随机分为正常组、模型组、倒卵叶五加组、佳蓉片组、维生素E 组，每组12只大鼠。D-半乳糖连续腹腔注射（320 mg/kg，50 d）建立亚急性衰老大鼠模型，各组大鼠在腹腔注射D-半乳糖 （正常组动物注射等量生理盐水）的同时，正常和模型组大鼠灌胃生理盐水（10 ml/kg）、其他各组依次给予倒卵叶五加（1 g/kg）、佳蓉片（6 g/kg）、维生素 E（20 mg/kg），用药 50 d。

1.3 抗氧化指标检测

大鼠末次给药后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，内眦取血2 mL，离心取上清；按照TBA 法检测MDA 含量，比色法检测GSH-Px，黄嘌呤氧化酶法检测SOD，铁还原法检测T-AOC 等指标。

1.4 NO、iNOS 含量

大鼠断头处死，每只大鼠取左侧睾丸组织约100 mg 滤纸吸干水分后称重，冰浴条件下切成小米粒大小组织块，加入适量冷生理盐水，制成10%组织匀浆，4 000 r/min离心12 min，取匀浆上清，以冷生理盐水稀释成需要浓度，酶标仪测定组织蛋白含量，按照试剂盒说明进行操作，测定睾丸组织N0、iNOS的含量。

1.5 统计学方法

数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t 检验，计数资料采用百分率表示，组间对比采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义，P＜0.01 为差异有高度统计学意义。

2 结果

2.1 抗氧化能力的影响

模型组大鼠MDA 含量明显升高，GSH-Px、SOD 活性T-AOC 明显降低，与正常组比较差异具有统计学意义（P＜0.01 或P＜0.05）。倒卵叶五加、佳蓉片和维生素E 明显抑制衰老大鼠MDA 含量升高；显著升高GSH-Px、SOD、T-AOC活性，各试药组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。 见表1。

表1 大鼠各指标检测结果（±s，n=12）

表1 大鼠各指标检测结果（±s，n=12）

注：与模型组比较，*P＜0.01，**P＜0.05

组别 MDA（nmol/mL）GSH-Px（U/mL）SOD（U/mL）T-AOC（U/mL）正常组模型组倒卵叶五加组佳蓉片组维生素E 组2.35±0.75*5.12±0.94 2.51±0.70*2.45±0.69*2.41±0.64*19125±430**1410±259 4148±398**4208±3021**5023±289**201±22**147±19 198±18*189±19*210±23**201±22**147±19 198±18*189±19*210±23**

2.2 睾丸组织NO 和iNOS的含量

模型大鼠睾丸组织NO 和iNOS的含量明显升高，与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）；倒卵叶五加、佳蓉片和维生素E 显著降低睾丸组织NO 和iNOS含量，与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠睾丸组织NO和iNOS的含量（±s，n=12）

表2 各组大鼠睾丸组织NO和iNOS的含量（±s，n=12）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 体重（g） NO[U/（mg ·prot）] iNOS[U/（mg ·prot）]正常组模型组倒卵叶五加组佳蓉片组维生素E 组280.3±23.00 268.8±21 277.3±24 279.5±22 280.5±30 2.44±0.15**5.40±0.352.38±0.42**2.43±0.19**2.45±0.20**29.88±1.35*51.40±1.89 33.49±1.55*34.21±1.66*32.38±1.65*

3 讨论

刘国强等[6]报道，MDA的含量可代表脂质过氧化产物的浓度，间接反映组织的损伤程度。所以，MDA是机体衰老过程中产生的过量超氧阴离子自由基与脂质发生过氧化反应的终产物[7]。GSH-Px是机体广泛存在的重要的过氧化物分解酶，其功能是催化谷胱甘肽（GSH）参与过氧化反应，清除细胞在呼吸代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，从而减轻不饱和脂肪酸的过氧化作用。Giardino 等[8]早在2002年就证实，随着年龄增加机体氧化还原平衡逐渐被打破，过氧化产物不断积累、抗氧化物质的含量明显下降，导致衰老。正常情况下，SOD的功能是清除体内新陈代谢过程中产生的自由基，使机体氧化与抗氧化保持平衡[9]；T-AOC 反映体内酶性和非酶性抗氧化物的总水平，血清T-AOC 含量是全面评估机体抗氧化能力的重要指标。

倒卵叶五加是佳蓉片中的君药。倒卵叶五加具有健脾益气、补肾宁心、舒筋活络的功能，适用于体虚乏力、食欲不振、腰膝酸软、阳痿、失眠多梦、健忘、风寒湿痹等。本研究证实，D-半乳糖致模型大鼠血清MDA 含量明显升高，SOD、GSH-Px 活性、T-AOC 明显下降， 说明模型大鼠抗氧化能力明显降低；倒卵叶五加、佳蓉片和维生素E 能明显降低D-半乳糖诱发的衰老大鼠血清MDA 含量，升高SOD、GSH-Px、T-AOC 含量；这不仅说明倒卵叶五加具有显著抗氧化应激能力并发挥抗衰老作用，同时也提示佳蓉片临床应用表现出的具有一定延缓衰老的功效应该与其君药地位密切相关。

细胞的能量代谢障碍及凋亡是多种器官衰老退化的重要基础，NO 能直接调控氧与血红素的结合与释放，进而控制对线粒体的氧供给，导致细胞内[10]水平下降，引起细胞凋亡[11]；睾丸组织是雄性生物生殖能力的重要器官，由此中医称“肾乃先天之本，生命之源”。本试验发现，D-半乳糖致衰老大鼠睾丸组织NO、iNOS的含量均明显增高，与文献报道[12]一致；采用倒卵叶五加、佳蓉片和维生素E 干预，能明显降低衰老大鼠睾丸组织NO 和iNOS的含量，说明倒卵叶五加等可通过调节睾丸组织NO、iNOS的含量抑制细胞凋亡，从而延缓睾丸组织的衰老。但是，倒卵叶五加是佳蓉片的君药，临床主适应证是用于妇女更年期综合征，那么，对雌性生殖器官的作用如何，本课题组的研究尚在进行中。

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