杨建生 潘 娟 (河南中医学院第二附属医院麻醉科，河南 郑州 450000)

术后认知功能障碍(POCD)表现为定向力、学习、记忆、注意等方面的认知功能下降，术后人格改变、记忆受损、社交及认知能力降低，多见于老年人〔1〕。环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)作为转录因子，在长时程记忆的过程中起重要作用〔2〕。突触素P38可调节神经递质释放、参与突触囊泡的导入、转运、再循环和突触发生，是学习记忆过程中的重要分子之一〔3〕。作为新型的静脉全麻药，乳化异氟醚可直接静脉应用，在治疗指数相似的前提下，其麻醉诱导作用及复苏均优于丙泊酚〔4〕，具有良好的临床应用前景，但对于其术后认知功能的影响尚缺乏认识。本研究选用老龄SD大鼠做麻醉模型，利用Morris水迷宫的记忆提取测试〔5〕，研究乳化异氟醚对大鼠记忆提取及CREB和P38表达的影响，探讨乳化异氟醚对记忆认知功能的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 健康SD雄性老年大鼠36只，体重为400～500 g(郑州大学实验动物中心提供)。随机分为空白对照组(C组，n=6)、30%脂肪乳组(E组，n=6)、8%乳化异氟醚组(EI组，n=24)，EI组共分 4个亚组(即 EI麻醉苏醒后 6 h、24 h、72 h、7 d 组，每组 n=6)。

1.2 药品和仪器 8%乳化异氟醚(委托郑州大学药理学实验室配制，以30%脂肪乳为载体，配制成液态异氟醚120 mg/ml、浓度为8%的制剂);30%脂肪乳(批号:20110509，西安力邦制药有限公司);大鼠Morris水迷宫测试仪(上海软隆科技发展有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 模型制备 麻醉前全部大鼠另加10只(候补)行Morris水迷宫实验，其中定位航行实验持续7 d，每天3次，在一圆形

水池中注满水，水池均分为4个象限(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，将平台置于Ⅰ象限，水面高于平台1～2 cm，将大鼠面向池壁按东、南、西、北4个入水点分次放入水中，记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间(逃避潜伏期)另加;第7天结束后2 h行探索实验，去除平台，从将大鼠从Ⅲ象限投入水中将大鼠放入水中，记录大鼠120 s内在平台象限停留时间，考察其对原平台的记忆。平台象限游泳的距离百分比超过30%表明参与大鼠形成了对平台位置的空间记忆，以此为大鼠入选标准。不及格者或多余者剔除。水迷宫实验于每日16时至20时完成，此后，各组行尾静脉穿刺，EI组静脉注射8%乳化异氟醚1.5 ml/kg。EI组以大鼠前爪翻正反射消失，夹尾反射消失为麻醉成功标准。E组给予等容量30%脂肪乳;C组给予等容量生理盐水。

1.3.2 行为学测试 停药到翻正反射恢复即表示麻醉苏醒。C组、E组于给药后6 h再次进行水迷宫实验，EI分别于麻醉苏醒后6 h、24 h、72 h、7 d时各取6只大鼠行水迷宫实验，每次定位航行实验结束后2 h行探索实验。记录数据。

1.3.3 CREB(p-CREB)及突触素P38的表达测定 行为学测试结束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 ml/kg)后颈椎脱臼法处死大鼠，取海马组织200 mg，各100 mg低温状态下加入裂解液(1 mg∶4 μl)进行组织裂解，匀浆，离心等操作后提取上清液，此即为全蛋白提取物，BCA法进行蛋白定量。将全蛋白提取物进行电泳，转膜，封闭后，置于相应的一抗稀释液4℃缓慢摇动孵育过夜。洗膜，置于相应的二抗稀释液中，室温孵育1 h。洗膜，孵育底物，化学发光显色。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0系统分析数据。计量资料以±s表示，组间两两比较采用多组定量资料的单因素方差分析LSD法。

2 结果

2.1 各组水迷宫实验结果 E组与C组间各指标比较无差异(P＞0.05);与C组比较，EI组麻醉苏醒后6 h、24 h时逃避潜伏期延长，平台象限停留时间缩短;72 h、7 d时各指标变化无统计学意义(P＞0.05);与麻醉苏醒后6 h时比较，72 h、7 d时逃避潜伏期缩短及平台象限停留时间延长(P＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠逃避潜伏期及平台象限停留时间比较(n=6，±s)

表1 各组大鼠逃避潜伏期及平台象限停留时间比较(n=6，±s)

与C组比较:1)P＜0.01;与麻醉苏醒后6 h时比较:2)P＜0.05

组别 逃避潜伏期(s) 平台象限停留时间(s)C组 处理后6 h 14.67±2.4 50.33±3.98 E组 处理后6 h 14.00±1.4 48.01±6.23 EI组麻醉苏醒后6 h 19.00±1.41) 40.00±2.371)麻醉苏醒后24 h 17.67±2.421) 39.67±2.161)麻醉苏醒后72 h 14.00±1.792) 47.50±4.512)麻醉苏醒后7 d 12.67±1.032) 50.02±5.292)

2.2 各组CREB、突触素P38表达 E组与C组间各指标比较差异无统计学意义(P＞0.05);与C组比较，EI组麻醉苏醒后6 h、24 h时海马CREB(p-CREB)及突触素P38表达下调(P＜0.05);72 h、7 d时各指标变化无统计学意义(P＞0.05);与麻醉苏醒后 6 h时比较，EI组 72 h、7 d时海马组织 CREB(p-CREB)及突触素P38含量增高(P＜0.05)。Western印迹结果见图1，图2。

图1 各组大鼠海马区p-CREB蛋白电泳图

图2 各组大鼠海马区P38蛋白电泳图

3 讨论

POCD属术后中枢神经系统并发症之一，表现为记忆受损或人格改变，可伴有语言总结能力降低和行为异常〔6〕。老年患者组织器官发生退行性改变，对围术期伤害性刺激引起的应激反应的调节能力降低，是发生POCD的高危人群〔7〕，随着接受手术者人口基数增加，发病人数逐年增高，临床工作不容忽视。

已证实EI静脉应用可产生确切而可逆的麻醉作用，兼具静脉和吸人挥发性麻醉药的优点，在治疗指数相似的情况下，EI的麻醉诱导与麻醉复苏均优于丙泊酚〔8〕，且乳化异氟醚在大鼠静脉注射时的ED50和LD50分别为:0.07和0.22 ml/kg，用量小〔4〕，故EI具有良好的临床应用前景。但其对术后认知功能的影响缺乏进一步的研究。

Morris水迷宫是研究脑学习记忆机制的一种实验手段，其中定位航行实验可反映动物的学习记忆能力，空间搜索实验反映动物的空间联想能力及回忆探究能力。由于C组和E组在4个时间点的行为学差异无统计学意义，遵照动物实验“少量”的原则，在后续蛋白检测中未进一步分组。同时参照大鼠异氟醚麻醉后 POCD的研究结果，设置4个时间点;用药剂量(1.5 ml/kg)〔8〕。本研究提示，乳化异氟醚麻醉后可引起认知功能、回忆提取功能下降，但其影响呈一过性，72 h后基本恢复。认知功能是大脑高级功能，包括学习记忆的形成及记忆的提取。CREB与空间记忆的形成密切相关，并在神经元的可塑性和大脑长期记忆的形成中起重要作用。Guzowski等〔9〕在转基因小鼠研究中发现，CREB在恐惧记忆的巩固及提取再巩固的过程起重要作用。

突触素P38是一种钙结合糖蛋白，其构成突触囊泡特异性的膜通道，参与囊泡的转运和递质的释放，与突触可塑性关系密切，在培养的海马神经元突触发育时伴随突触素P38高水平表达〔10〕。同时突触素还是突触传递效能的反映〔12〕，因而突触素蛋白可以反映突触的信息传递及递质释放，亦可反映神经传递的增减及认知功能的强弱〔11，12〕。本研究中，EI组 6 h、24 h认知功能、回忆提取功能降低，同时伴有CREB、P38表达的减低，印证了CREB在记忆提取过程中的作用以及突触素P38在记忆形成和递质传递中的作用，并在分子生物学层面验证了麻醉后大鼠认知功能的下降;72 h、7 d时行为学测试成绩较6 h、24 h相比有提升，与C组相较，无明显差异，同时CREB和P38的表达量有增加，进一步明确了CREB、P38在认知过程中的作用，并提示乳化异氟醚所致POCD呈一过性，麻醉结束后72 h可恢复，为可逆性改变。

1 Steinmetz J，Christensen KB，Lund T，et al.Long-term consequences of postoperative cognitive dysfunction〔J〕.Anesthesiology，2009;110(3):548-55.

2 Porte Y，Buhot MC，Mons NE.Spatial memory in the Morris water maze and activation of cyclic AMP response element-binding(CREB)protein within the mouse hippocampus〔J〕.Learn Mem，2008;15(12):885-94.

3 Masliah E，Terry RD，Alford M，et al.Quantitative immunohistochemistry of synaptophysin in human neocortex:an alternative method to estimate density of presynaptic terminals in paraffin section〔J〕.J Histochem Cytochem，1990;38(4):837-44.

4 周建新，罗南富，刘 进，等.乳化异氟醚静脉麻醉的量效关系〔J〕.中国临床药理学杂志，2003;19(6):437-9.

5 Brandeis R，Brandys Y，Yehuda S.The use of the Morris Water Maze in the study of memory and learning〔J〕.Int J Neurosci，1989;48(1-2):29-69.

6 Beattie WS，Badner NH，Choi P.Epidural analgesia reduces post-opera-tive myocardial infarction:a meta-analysis〔J〕.Aneath Armlg，2001;93(11):853-8.

7 Chen X，Zhao M，White PF，et al.The recovery of cognitive function after general anesthesia in elderly patients:an comparison of destlurane and 8evonuⅫe〔J〕.Anesth Analg，2001;93(48):1489-94.

8 周建新，罗南富，刘 进，等.序贯法测定乳化挥发性麻醉药在大鼠静脉诱导中的半数有效量〔J〕.麻醉与监护论坛，2002;9(4):24-6.

9 Guzowski JF，Mc Gaugh JL.Antisense oligodeoxynucleotide-mediated disruption of hippocampal cAMP response element binding protein levels impairs consolidation of memory for water maze training〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1997;94(6):2693-8.

10 Nathan PJ，Cobb SR，Lu B，et al.Studying synaptic plasticity in the human brain and opportunities for drug discovery〔J〕.Curr Opin Pharmacol，2011;11(5):540-8.

11 Robinson PA.Neural field theory of synaptic plasticity〔J〕.J Theor Biol，2011;285(1):156-63.

12 Reddy PH，Mani G，Park BS，et al.Differential loss of synaptic proteins in Alzheimer's disease:implications for synaptic dysfunction〔J〕.J Alzheimer's Dis，2005;7(2):103-17.