张敬 李贞 王婧娇等

[摘要] 目的 研究口腔扁平苔藓（OLP）患者外周血中维甲酸相关核孤儿受体γt（RORγt）和4-1BB/4-1BBL mRNA的表达。方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）法检测30例OLP患者和30例健康人外周血中RORγt和4-1BB/4-1BBL的基因表达水平。结果 在OLP患者中，RORγt、4-1BB、4-1BBL mRNA的表达水平显著高于对照组（P<0.05），结果经2-ΔΔCT转换后，OLP组3种基因mRNA表达水平分别是健康对照组的3.087、3.320和4.005倍。RORγt和4-1BB mRNA的表达水平无明显相关性（P>0.05），4-1BB和4-1BBL mRNA表达水平呈正相关（r=0.455 0，P<0.05）。结论 RORγt和4-1BB/4-1BBL在OLP的发病中起了一定作用。

[关键词] 维甲酸相关核孤儿受体γt； 4-1BB； 4-1BBL； 口腔扁平苔藓

[中图分类号] Q 786 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.04.019

口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是发生于口腔黏膜的慢性炎症性疾病，T细胞介导的免疫异常是其重要的发病因素。研究结果显示：Th17细胞在自身免疫性炎症中处于重要地位[1-2]。维甲酸相关核孤儿受体γt（retinoid-related orphan receptor γt，

RORγt）主要分布于CD4+和CD8+淋巴细胞内，作为

Th17细胞的特异性转录调节因子，在Th17细胞分化发育过程中发挥着重要作用[3]。共刺激分子4-1BB/4-

1BBL属于肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体超家族成员，主要表达在活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）表面，其以受体配体相互作用的方式传导信号，维持T细胞的活化状态，延长其免疫应答效应[4]。本研究用实时荧光定量

聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitativepoly-merase chain reaction，FQ-PCR）方法检测OLP患者和健康人外周血中RORγt及4-1BB/4-1BBL的表达，比较RORγt及4-1BB/4-1BBL mRNA在2组之间的表达差异和相关性，初步探索其与OLP的关系，为OLP寻找可能的致病机制，并为治疗新策略的研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

1.1.1 对照组 30例健康人外周血标本为自愿者捐献，其中男17例，女13例。年龄为24～46岁，均无全身及口腔黏膜疾病诊断，肝肾功能正常，排除感染等可能影响免疫状态的情况。本研究通过医院伦理委员会批准，志愿者知情同意。

1.1.2 OLP组 30例OLP患者外周血标本来自宁夏医科大学附属医院口腔科门诊初次就诊的OLP患者（均经病理确诊）[5]，其中男12例，女18例，年龄为28～72岁，均排除合并其他自身免疫性疾病，未接受任何激素和免疫抑制剂治疗，排除感染等可能影响免疫状态的情况。

1.2 主要试剂和仪器

全血RNA提取试剂、逆转录试剂、FQ-PCR试剂均由广州达安生物技术有限公司合成。凝胶成像仪Gel Doc XR（BIO-RAD公司，美国），荧光定量

PCR仪（PRISM 7300，ABI公司，美国），台式高速冷冻离心机（Z36HK，HERMLE公司，德国），DU800紫

外分光光度仪（Beckman公司，美国）。

1.3 实验方法

1.3.1 引物的设计与合成 实验引物序列见表1。引物的设计经查询基因库和通过Primer Premier 5.0软件完成，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3.2 样本处理 取外周静脉血各2 mL，乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝

后，按全血提取试剂说明提取总RNA，用逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA，反应体系为：Oligo（dT）18引物1 μL，RNA模板5 μL（0.1 ng～5 μg），5×逆转录buffer 4 μL，逆转录酶1 μL，DEPC水加至20 μL。反应条件为：42 ℃ 60 min（逆转录反应），然后70 ℃

5 min（逆转录酶的失活反应），终止反应。合成的

cDNA于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.3 FQ-PCR检测 采用SYBR Green Ⅰ染料法，加样过程中避光操作。反应体系为：2×SYBR Green Mix 12.5 μL，上游引物F（10 μmol·L-1）0.5 μL，下游引物R（10 μmol·L-1）0.5 μL，cDNA 1 μL，ROX 0.05 μL，

dd水10.5 μL，总体积20 μL。

反应条件为：将制备好的检测样本上机。本实验采用三步法：50 ℃预处理2 min，1个循环；95 ℃预变性10 min，1个循环；然后95 ℃变性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；加收集熔解曲线反应条件。每个标本做2个复孔。扩增结束后系统软件自动绘制扩增曲线和熔解曲线。

1.3.4 数据分析 对RORγt、4-1BB、4-1BBL基因与内参基因β-actin进行PCR扩增，反应后，进入结果分析界面。通过比较目的基因的CT值（CT值为每个

反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数）与内参照基因β-actin的CT值之差，即ΔCT来表示RORγt、4-1BB、4-1BBL基因与内参基因β-actin的相对表达量，计算ΔΔCT，ΔΔCT=ΔCT（OLP组）-

ΔCT（对照组），目的基因在OLP组相对于对照组的表达差异倍数用2-ΔΔCT来表示，即是OLP患者与对照组相比，所检测目的基因的相对表达量。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，数据用均数±标准差（x±s）表示，FQ-PCR数据为计量资料，所有实验数据经正态性检验以明确其是否正态性分布，2组间采用t检验分析，相关分析采用Pearson直线相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 总RNA质量

紫外分光光度仪测定A260/A280，所有样本比值为1.8～2.0，说明总RNA质量较好。

2.2 RORγt、4-1BB和4-1BBL mRNA的表达

在30例健康人外周血和30例OLP患者外周血中，RORγt、4-1BB、4-1BBL基因均有表达，且在OLP组中的表达明显高于对照组（表2～4），以健康人外周

血中RORγt mRNA的表达量作为标准，在此基础上比较OLP组RORγt、4-1BB、4-1BBL基因的相对表达量。OLP组中RORγt、4-1BB、4-1BBL mRNA的表达量分别是对照组的3.087、3.320、4.005倍。

2.3 RORγt、4-1BB和4-1BBL基因表达水平的相关性

2.3.1 RORγt和4-1BB基因表达水平的相关性 对OLP组RORγt和4-1BB表达水平进行直线相关分析，绘制两者散点图，可见散点分布杂乱，无明显规律，

相关性分析结果表明2组数据关系不密切（r=0.332 2，

P>0.05）（图1）。

3 讨论

目前许多研究表明：OLP是一种由T细胞介导的免疫反应性疾病。CD4+T淋巴细胞及其分泌的细胞因子在其发病机制中起着关键作用[5]，根据产生细

胞因子和生物学功能的不同，将CD4+T淋巴细胞分为Th1、Th2及Tregs细胞亚群[6]。近年来，研究发现了

一种新型的Th细胞亚群，不同于Th1、Th2及Tregs细胞，以分泌白细胞介素（interleukin，IL）-17为主，被

命名为Th17细胞[7-8]，其在炎性反应、自身免疫性疾病、肿瘤和移植排斥等疾病中发挥了重要的作用。现已证实RORγt是促进Th17细胞分化、调节其功能的特异性转录调节因子[9]。RORγt基因是RORC的一种剪接变异体，RORγt作为辅助性Th17细胞的特异性转录调节因子，主要分布于CD4+和CD8+淋巴细胞内。在体外实验中发现，将CD4+T细胞中的RORγt基因敲除后则不表达IL-17，而通过基因载体将RORγt过表达，则发现CD4+T细胞不需要其他外来的细胞因子便可以表达IL-17。在实验性变态反应性脑脊髓炎（experimentally allergic encephalomyelitis，EAE）小鼠模型中，RORγt缺陷的小鼠肠固有层IL-17表达明显降低，且肠道易于感染，EAE发病延缓，病情减轻，由此证实了RORγt在Th17细胞分化中起关键性的作用[3]。

本实验结果显示30例OLP患者和30例健康人外周血中均检测到RORγt mRNA的阳性表达；OLP组RORγt mRNA表达量明显高于对照组（P<0.05），表

达水平是对照组的3.087倍，显示OLP患者RORγt基因表达相对于正常人上调。在系统性红斑狼疮、过敏性紫癜患者外周血中检测到RORγt mRNA的表达量均较对照组显著性增多。结果提示OLP患者RORγt上调导致T细胞趋向Th17分化增多，导致一系列炎症及自身免疫性反应。

研究[10]发现：4-1BB是肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族成员，主要表达在活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞表面。4-1BBL相对分子质量为34 000，属肿瘤坏死因子（tu-

mor necrosis factor，TNF）超家族成员，其表达在B细胞和活化的T细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞（dendritic cells，DC）、滤泡树突状细胞（follicle dendritic cell，FDC）上[11-12]。4-1BB/4-1BBL是在T细胞初次和再次应答过程中一对重要的共刺激分子，其以受体配体相互作用的方式传导信号，能有效刺激CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化，分泌细胞因子及调节其增殖和存活，延长其免疫应答效应。4-1BB/4-1BBL在系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、强直性

脊柱炎等自身免疫性疾病外周血淋巴细胞上均有异常表达。

本研究结果显示30例OLP患者和30例健康人外周血中均检测到4-1BB mRNA和4-1BBL mRNA阳性表达，且在OLP患者中的表达均明显高于健康对照组（P<0.05），提示4-1BB、4-1BBL的异常表达参与了OLP的发病，OLP患者可能存在CD4+T细胞的活化、增殖和分化异常，这也可能是其参与免疫炎性反应发生发展的原因之一。

本研究对OLP组RORγt和4-1BB表达水平进行相关分析，结果显示2组数据关系不密切，RORγt和4-1BB在OLP患者的表达无相关性（P>0.05），提示初始CD4+T细胞在第一信号和4-1BB/4-1BBL第二信号的共同作用下活化，在RORγt存在的的条件下，分化为Th17细胞，进而执行相应的生物学功能。这是一个非常复杂而精细的过程，还需要应用多种不同的方法或更进一步深入的研究来探索其机制。对OLP组4-1BB、4-1BBL mRNA的表达水平作出相关分析，结果显示4-1BB与4-1BBL表达呈正相关（P<0.05），

分析认为当机体受到外界免疫刺激后，引发了共刺激信号4-1BB/4-1BBL的异常激活，使两者表达均增高，因此两者呈正相关，这也提示这对共刺激分子表达水平的共同升高可能在OLP的发病中起一定的作用，但具体的机制还需要更深入的研究。

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（本文编辑 杜冰）