唐 文，吴安花，向玲丽，叶合生，胡琦，杨粤军

（湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410013）

1975年，Goodpasture和Howell 等应用银氨法特异地染色核仁形成区，证实银染的位置是染色体上核糖体基因(rDNA）的位置。此后进一步证明银染物质不是rDNA，也不是rRNA，而可能是核仁形成区特异的蛋白质，即和rRNA 转录相联系的酸性蛋白。核仁组成区相关嗜银蛋白（Ag-NORs）是一种酸性非组蛋白C23，在rDNA 转录活性中起重要调控作用。核仁组成区银染强度反映了rDNA 转录活性水平，与细胞增殖活性密切相关[1],已被不少学者用于肿瘤的分级和癌前病变的诊断检测,对于良恶性病变的鉴别诊断价值很大[2]，有人用核仁组成区相关嗜银蛋白这个技术对比检测良、恶性骨肿瘤细胞进行检测[3]，也有实验室用此技术测量眼组织的活性[4]；还有医生以核仁形成区银染蛋白的指标评价肿瘤患者免疫状况[5]。我们的实验是采用不同人群的毛囊细胞，用核仁组成区相关嗜银蛋白检测活性，找到他们之间的差异。为进一步研究毛囊细胞活性与毛发的生长的关系提供基础。

1 材料和方法

1.1 标本选择

年轻男女，小孩，老年男女各50人带毛囊细胞的毛发。

1.2 染色液的制备

2%的白明胶液：取2g 明胶溶于1%甲酸水溶液100mL中混匀。50%硝酸银水溶液。

1.3 方法

用镊子取毛囊细胞的头发2～3 根置载玻片中央，加2～3 滴40%醋酸液，室温放置10 分钟左右，使毛囊软化，用刀片刮下毛囊细胞，弃去头发，用刀尖或针尖将毛囊细胞分散并均匀涂于载玻片中央，在酒精灯上远火干燥；加2～3 滴固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），固定15 分钟，自然干燥；加5N 盐酸2～3滴，静置10 分钟；用蒸馏水冲去盖玻片及多余染液，自然晾干；将玻片标本置入下铺潮湿吸水纸的容器中，容器放入37℃水浴箱；在标本上加染色液2 滴，用洗耳球吹匀，盖下水浴箱盖，37℃15 分钟（此步一定要避光）。

取出标本用蒸馏水充分冲洗，干燥后，即可镜检观察。观察分析：在显微镜下可见间期核和中期分裂相的染色体被染成黄色，核仁被染成黑色，某些染色体上有银染黑点，即核仁形成区。AgNOR 计数 按Crocker 推荐方法[6]油镜下随机数1100 个毛囊细胞，计数每个细胞核内AgNOR 颗粒数，求出平均值。

2 结果

结果显示，不同年龄，不同性别，以及头发的黑白不同AgNORs 颗粒数量不同，而且分布也不相同。通过大量实验大量图片的比较发现，黑发毛囊细胞中核仁银染着色比白发毛囊细胞中核仁银染颜色要深；而部分老年白发毛囊细胞中可无银染核仁；成人毛囊细胞中核仁体积较小孩毛囊细胞中核仁体积小。

AgNOR 颗粒计数：男性组每个细胞核内通常只见1～2 个圆形的黑色银染小颗粒，可见3 个，平均1.28±0.47。女性组细胞核内银染颗粒数目较多，常为2 个，可见3～4 个，平均1.88±0.33。经统计学处理每个细胞核内AgNOR 颗粒平均数在男女老少及白发与黑发之间，见图1。统计的毛囊细胞银染核仁数见表1。

3 讨论

Howell 认为NOR的银可染性反映了rRNA 基因的活性。只有有转录活性或已经转录过的，并且其上仍有残余的与RNA 相联系的蛋白质的核仁形成区才能被银染色。没有银染粒的NOR 可能意味着rDNA 顺反子不转录rRNA，即这些位点没有与rRNA 相联系的银可染的蛋白质。银染法是目前表征rDNA 基因功能的一个准确的方法。人类核糖体RNA 基因位于5 对近端着丝点染色体短臂的次缢痕处，即人类的核仁形成区。在正常人中不是所有核仁形成区均被银染，其范围大约4-10 个。应用银染法可以觉察正常人体核糖体RNA 基因的活动。因此，应用银染核仁形成区（Ag-NOR）技术，可以分析有活性的rRNA 基因的动态变化。

图1 发毛囊细胞核中AgNOR 颗粒

表1 不同人群毛囊细胞活性统计表

本文观察到，老年白发毛囊细胞的活性最低，年轻男女的毛囊细胞活性最强，年轻男女之间活性差别不大。各个不同人群毛囊细胞活性比较分别是：年轻女黑发＞年轻男黑发＞年轻男白发＞老年黑发＞年轻女白发＞小孩黑发＞老年白发。

Ag-NORs 是位于某些染色体上特殊部位的核糖体基因rDNA，通过其转录而形成核糖体RNA，在蛋白质合成中起极其重要的作用。研究表明，Ag-NORs 可能就是调节rDNA 转录的聚合酶Ⅰ的亚单位，起保持rDNA 链伸展的作用，对核糖体的形成及细胞内蛋白质合成至关重要，可作为rDNA转录活性的标志及蛋白质合成的活跃状态，来反映核仁结构和功能的变化[7]。Ag-NORs 数目与细胞动力学、染色体核型中带有NORs 数目及细胞周期有着密切的关系[8]。

毛囊细胞是决定头发生长、浓密程度的关键。普通人的毛发每28～30天为一个更新周期，受外环境及年龄等因素的影响，毛囊非常容易坏死萎缩，导致严重的脱发问题。科学家经过多年的研究，发现只要再次激活萎缩受损的毛囊，头发就能得到重生。而我们用核仁组成区相关嗜银蛋白（Ag-NORs），测量男女老少之间、白发与黑发之间的毛囊细胞活性，发现不同人群之间毛囊细胞活性的变化，为进一步研究毛发的生长提供基础。

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[3]齐继峰,海涌,马华松.核仁组成区相关嗜银蛋白对良、恶性骨肿瘤检测的临床意义[J].细胞与分子免疫学杂志,2001,4,400.

[4]钟一声,王康孙.眼组织AgNOR 染色及其意义[J].眼科新进展，2000,03,181-183.

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[6]How should we count AgNORs Proposale for a standarized approach,Crocher J,Boldy DA,Egan MJ.［J］.J Pathol,1989,158(3)：185.

[7]plotton D,Menger M,Jeannesson P,et al.Improvement in the staining visuacization of the argyrophilic proteins of nuceloar organizer regions at the optical level [J].Histochem J,1986,18：5-14.

[8]Underwood JCE,Giri DD.Nucleolar organizer region as diagnostic discrimonants for malignancy [J].J pathol,1988,155(2)：95-96.