杨朴丽 许俊强 刘智宇 王志敏 张丹华 汤青林 宋 明

（西南大学园艺园林学院，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆市蔬菜学重点实验室，重庆 400715）

结球甘蓝雌蕊调控转录因子SPT基因的克隆与序列分析

杨朴丽 许俊强 刘智宇 王志敏 张丹华 汤青林*宋 明*

（西南大学园艺园林学院，南方山地园艺学教育部重点实验室，重庆市蔬菜学重点实验室，重庆 400715）

以结球甘蓝E1为材料，提取花蕾总RNA，反转录cDNA。根据拟南芥SPT基因设计引物，采用同源克隆的方法从中克隆SPT基因序列1085 bp，开放阅读框1062 bp。通过cDNA推导得到的氨基酸序列分析表明，BoSPT编码353个氨基酸残基，预测分子量为37.67 kD，pI为6.83。经过EcoRⅠ和KpnⅠ限制酶双酶切后，构建原核表达质粒pET43.1a-BoSPT转化表达菌株E. coli Rosetta （DE3），通过SDS-PAGE 检测该蛋白的表达。经Smart-embl预测其具有bHLH家族结构域，位于序列第173～221位氨基酸残基处。进化树表明结球甘蓝BoSPT与拟南芥AtSPT和筷子芥AlSPT的亲缘关系较近。BoSPT基因的原核表达得到纯化的融合蛋白。

结球甘蓝；雌蕊；SPT；基因克隆；序列分析

雌蕊是种子植物的雌性繁殖器官，由心皮、花柱和子房组成并最终发育形成果实，其生长发育情况对作物的产量、质量都有决定性的影响，同时雌蕊发育的好坏对植物是否能够繁殖也起到至关重要的作用。SPATULA（SPT）是第一个被发现在植物花器官发育过程中起到重要作用的基因（Alvarez ＆ Smyth，1999）。Heisler等（2001）应用原位杂交技术得出，SPT基因在花分生组织的顶部就开始表达，此部位随后发育成雌蕊原基，SPT基因在雌蕊原基中部表达最强；随着雌蕊原基的生长发育，随后继续分化出隔膜、柱头、花柱和输送管，在此发育过程中不同组织中都有SPT基因的表达。直至开花前，在隔膜和柱头上SPT基因的表达才消失，但在角果瓣片上却可检测到SPT基因的表达，然后随着发育的进程，SPT基因表达渐渐集中到瓣片边缘，此部位会进一步发育成瓣片分裂区，保证果实正常开裂。在拟南芥中发现，SPT功能缺失会导致隔膜和顶端心皮融合缺陷，以及传输束丧失和柱头组织发育的减少（Heisler et al.，2001；Alvarez ＆ Smyth，2002）。由此推断，SPT基因在整个雌蕊发育过程中是必不可少的。

拟南芥心皮发育还受到花器官确定基因AGA（AGAMOUS）和MADS-box成员CRABS CLAW（CRC）基因的调控（Alvarez ＆ Smyth，1999，2002）。Alvarez和 Smyth（1999）发现CRC可抑制正在发育的雌蕊的横向生长，促进其轴向生长。CRC基因的突变将引起雌蕊呈现较宽而短的结构，且使两心皮在顶点处呈非融合状态（Fourquin et al.，2007）。AGA基因在花器官建成中为C组的基因，对于维持心皮生长发育特性以及花柱顶端的生长是不可缺少的（Gloz &Hudson，2002）。有研究发现这3个基因在心皮的发育过程中是平行起作用的，而并非上下游关系，SPT与这两个基因的并联行为调节成熟雌蕊所有元件，也有遗传学的证据表明CRC可以增进SPT与 AGA 的功能（Alvarez ＆ Smyth，1999；Fourquin et al.，2005）。Gremski等（2007）研究发现SPT与其他bHLH编码的转录因子HECATE（HEC）在隔膜、传输束和柱头重叠表达形成二聚体调控雌蕊生长发育。同时研究发现在拟南芥中SPT除了可以调控雌蕊的发育外，在子叶（Josse et al.，2011）、叶片（Jorgensen ＆ Tyers，2004；Ichihashi et al.，2010）、根（Makkena ＆Lamb，2013）、果实（Girin et al.，2011；Groszmann et al.，2011）等器官中都有作用，同时对种子的萌发也起到了一定的作用（Penfield et al.，2005）。所以可以说SPT的功能贯穿了植物的整个生命周期，但是SPT的主要功能是在雌蕊受精之前影响花器官的发育。因此对雌蕊调控转录因子SPT的研究是有重要意义的。

近年来，SPT在模式植物拟南芥中已有深入的研究，然而在其他作物中的报道还相对较少。拟南芥和甘蓝（Brassica oleracea L.）同为十字花科草本植物，不同的是甘蓝为芸薹属中重要的蔬菜作物。目前，赵燕等（2009）从荠菜（Capsella bursapastoris）中克隆到了与SPT相关的同样影响雌蕊发育过程的CRC基因，但甘蓝SPT基因的研究至今仍未见报道。本试验根据拟南芥SPT基因设计引物，通过同源克隆法从试验材料结球甘蓝E1中得到了SPT基因。进一步对其进行序列分析及同源性对比，结合原核体外表达技术，为后续在甘蓝中SPT与其他蛋白如HEC的相互作用调控雌蕊生长发育的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

结球甘蓝E1由重庆市蔬菜学重点实验室提供。种子播种和植株生长均在RXZ 型智能人工气候箱中，采用20℃/16 h光照与18℃/8 h黑暗的光周期，成苗后移栽于试验田，经过冬季低温春化。2013年3月取盛花期自交不亲和系花柱于-80℃冻存，用于RNA提取。

根据拟南芥SPT基因序列（NCBI 登录号NM_119857.2）设计引物对。SPT-F：5′-GCGgA ATTCATGGGAGATAAGAAATTGAT-3′；5′为带保护碱基的EcoRⅠ酶切位点；SPT-R：5′-GCGgGTACCATGGATTCTGACATAATGAACA-3′；5′为带保护碱基的KpnⅠ酶切位点。

1.2 花蕾SPT基因的cDNA和gDNA的克隆与序列分析

根据拟南芥基因保守区域设计PCR 扩增引物BoSPT-F 和BoSPT-R用于cDNA 序列的扩增，RT-PCR 扩增体系为ddH2O15.4 μL，10×PCR 缓冲液2.5 μL，2mmol·L-1dNTP2.5 μL，25mmol·L-1mgSO41.6 μL，BoSPT-F/BoSPT-R 各1 μL，KODdNA 聚合酶0.5 μL，模板dNA0.5 μL。PCR 扩增程序为94℃3min；94℃30 s，50℃30 s，72℃30 s，38 个循环；72℃5min。回收目的片段分别连接到pEASY-Blunt simple 载体，转化至E.coliJM109感受态细胞，进行蓝白斑筛选后，挑取阳性克隆进行酶切鉴定并送测序。

1.3 表达质粒的构建与体外表达

使用OMEGA Plasmidminiprep 试剂盒提取SPT目的基因质粒，分别经EcoRⅠ/KpnⅠ双酶切后定向插入原核表达载体pET43.1a，重组质粒转化大肠杆菌JM109。提取重组质粒并命名为pET43.1a-BoSPT分别经EcoRⅠ/KpnⅠ双酶切鉴定和华大基因公司测序验证。

将重组质粒pET43.1a-BoSPT转化表达菌株E. coliRosetta （DE3）。挑取单菌落，接种于5mL含有50 μg·mL-1氨苄青霉素的LB 液体培养基，37℃振荡培养过夜。次日，过夜培养物按1︰100扩大培养，当OD600在0.8～1.0时加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），按照L9（34）正交设计筛选融合蛋白表达条件（表1）。

表1 IPTG诱导原核表达条件的正交设计

1.4 融合蛋白纯化

由1.3中确定的最佳条件培养含有pET43.1a-BoSPT 的E. coliRosetta （DE3），并按TOYOBOmagExtractor-His-tag-蛋白纯化试剂盒说明纯化其体外表达的重组蛋白产物。诱导结束后离心收集菌体，使用Ni2+-NTA 柱（Qiagen）纯化融合蛋白，以转化pET43.1adNA空载体的E. coliRosseta 作为对照，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白。

2 结果与分析

2.1 BoSPT基因克隆

提取花蕾RNA（图1）反转录cDNA，设计引物克隆得到BoSPT基因cDNA序列，全长1085 bp，开放阅读框（ORF）1062 bp（图2），GC含量54.37%。根据其cDNA序列推导得到BoSPT蛋白共353个氨基酸残基序列，预测分子量为37.67 kD，等电点为6.83。

2.2 BoSPT基因序列分析

通过SignalP分析（http://genome.cbs.dtu.dk/ services/SignalP-2.0/）该蛋白不含信号肽，PSORT及（TargetP http://genome.cbs.dtu.dk/ services/TargetP/）软件预测亚细胞定位表明，BoSPT蛋白位于细胞核中的可能性最大，在其他部位可能性较小，说明BoSPT蛋白是一种核蛋白且由7个外显子组成，编码353个氨基酸。

图1 甘蓝总RNA电泳图谱

图2 SPT基因cDNA PCR产物电泳图谱

在线预测分析（http://smart.embl-heidelberg.de/）表明，BoSPT蛋白具有bHLH家族结构域，位于第173～221位氨基酸处，两亲性螺旋位于（DEISLFLRHII）第34～44位氨基酸残基，是蛋白-蛋白相互作用的位点，且保守的两亲性螺旋可能也与共激活子蛋白作用。酸性结构域（ETDGYDCESEEGVE）位于第139～152位氨基酸处，富含酸性残基。两个核定位信号（KRCR、KRRR）分别位于第169～172位氨基酸和第182～184位氨基酸处，该区域对SPT功能非常重要。Beta链位于第222～230位氨基酸处。跨膜域分析表明（http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/），该蛋白不含跨膜区，且位于膜外（图3）。

图3 SPT核苷酸序列分析

2.3 BoSPT磷酸化位点预测

用NetPhos2.0 Serve 软件预测BoSPT基因翻译后修饰，结果显示BoSPT蛋白有可能发生磷酸化的位点共有36个（图4）。丝氨酸（Ser）有可能发生磷酸化的位点有31 个，分别在肽链的第9、10、12、15、22、25、31、32、48、49、53、61、85、102、125、130、131、132、133、137、148、167、168、180、186、202、209、276、296、309位和第314位氨基酸处；苏氨酸（Thr）可能发生磷酸化的位点有3个，分别在肽链的第84、245位和第263位氨基酸处；酪氨酸（Tyr）可能发生磷酸化的位点有2个，分别在肽链的第91位和第144位氨基酸处。

图4 BoSPT磷酸化位点分析

2.4 BoSPT进化树分析

经氨基酸序列NCBI比对，BoSPT属于转录因子超家族。序列分析结果显示BoSPT具有动植物转录因子特有的bHLH结构域。从NCBI数据库检索到部分与BoSPT氨基酸序列同源性较高的高等植物蛋白家族氨基酸序列，经ClustalX2比对，通过MEGA5软件构建系统发生树（图5），结果表明，结球甘蓝BoSPT与拟南芥AtSPT（NM_119857）和筷子芥AlSPT （XP_002866965）位于相同的进化枝上，与两者的同源性最高（图5）。

图5 SPT蛋白分子进化树分析

2.5 表达质粒的构建与鉴定

构建的表达质粒pET43.1a-BoSPT，经EcoRⅠ/KpnⅠ双酶切可得到1060 bp左右条带（图6），表达质粒送华大基因公司双向测序，结果插入pET43.1a载体的位点和方向完全正确。

2.6 重组蛋白的诱导表达与SDS-PAGE检测

表达产物的SDS-PAGE 结果（图7）显示，有pET43.1a-BoSPT重组蛋白表达的特异条带出现（图7，1～9泳道），其蛋白质相对分子量均与预期值103.67 kD相符，而未诱导的菌液（对照）不见此条带（图7，0泳道）。由此证明表达质粒pET43.1a-BoSPT构建正确，且融合蛋白在大肠杆菌中成功表达。由图7看出在不同的诱导条件下，该融合蛋白均有较高的表达量，第2、3、4、6、7、8、9泳道的表达量相近，而1、5泳道的表达量相对较弱。本试验选用第7泳道（对应表1中第7组的诱导条件，即0.1mmol·L-1IPTG在37℃诱导2 h，融合蛋白表达量最高，该条件为最佳培养条件），采用TOYOBOmagExtractor-His-tag-蛋白纯化试剂盒纯化体外表达的融合蛋白pET43.1a- BoSPT，纯化后可得到目的条带。

图7 pET43.1a-SPT不同诱导条件的SDS-PAGE电泳图谱

图6 pET43.1a-BoSPT酶切电泳图谱

图8 纯化的pET43.1a-BoSPT融合蛋白SDS-PAGE电泳图谱

2.7 融合蛋白纯化检测

根据2.6得出的结果确定含有pET43.1a-BoSPT 的E. coliRosetta （DE3）的最佳培养条件，并按TOYOBOmagExtractor-His-tag-蛋白纯化试剂盒说明纯化其体外表达的重组蛋白产物。诱导结束后离心收集菌体，使用Ni2+-NTA柱（Qiagen）纯化融合蛋白，以转化pET43.1adNA空载体的E. coliRosseta 作为对照，通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白，如图8所示，纯化的pET43.1a-BoSPT融合蛋白目标条带准确清晰，目标条带预期值103.67 kD。

3 结论与讨论

本试验通过同源克隆的方法从甘蓝中获得了SPT基因，编码了353个氨基酸。经ClustalX2比对，通过MEGA5软件构建系统进化树，可以看出，结球甘蓝BoSPT与拟南芥AtSPT（NM_119857）和筷子芥AlSPT（XP_002866965）的同源性最高。从而在一定程度上说明了这3个物种可能是由一个共同祖先进化而来。将试验中克隆得到的SPT基因所编码的BoSPT蛋白进行NCBI比对，发现BoSPT属于转录因子超家族。序列分析结果显示在第173～221位氨基酸处BoSPT具有动植物转录因子特有的bHLH结构域。bHLH区域含有两个保守结构域：一个保守的两亲性分子螺旋和一个酸性域，还带有两个保守的在bHLH域N末端重叠的核定位序列及一个Beta链。因为bHLH家族结构域可能具有与蛋白或DNA结合成二聚体的能力，所以在不同的器官中所结合的蛋白与基因可能是不相同的。这便可以在一定程度上解释了为何叶片与心皮为同源组织，但在spt突变体中，叶片形状和叶片不同组织发育完整没有缺陷，而在花的心皮边际却有特异性组织发育缺陷（Alvarez ＆Smyth，1999；Fourquinetal.，2005；Ichihashietal.，2010）。

BoSPT蛋白在第139～152位氨基酸处具有酸性结构域（ETDGYDCESEEGVE），富含酸性残基，而SPT的酸性结构域是心皮发育所必需的（Groszmannetal.，2008）。已有研究表明SPT酸性结构域是转录助激活剂的作用位点。基础转录机制是间接激活而不是直接激活。当然在一些转录因子中，酸性域也被鉴定为直接的激活子，但是这一类转录因子只是富含酸性残基，而不拥有严格的保守序列和结构（Ptashne ＆gann，1997）。两亲性螺旋位于（DEISLFLRHII）第34～44位氨基酸残基，两亲性螺旋结构在心皮的发育过程中所起的作用并不像酸性结构域那样是必须的，但其对酸性结构域起到支持作用（Groszmannetal.，2008）。两个核定位信号（KRCR、KRRR）分别位于第169～172位氨基酸和第182～184位氨基酸处，Beta链位于第222～230位氨基酸处，有研究表明在与保守Beta链相邻的bHLH的C末端的一个突变导致SPT功能缺失（Mitsuda ＆Ohme-Takagi，2009）。位于C端与bHLH 域毗邻的Beta链的延伸对SPT心皮功能也是相当重要，因其位于参与二聚化作用的bHLH域下游，可能提供额外的二聚化接触点。它与bHLH-Zip蛋白的亮氨酸拉链结构域的作用可能是平行的（Blackwood ＆ Eisenman，1991），都具有促进其二聚搭档特异性的作用（Souceketal.，1998）。目前，有研究报道显示SPT和另一个bHLH转录因子HEC蛋白之间存在相互作用，形成二聚体可能调控下游的目标基因（Gremskietal.，2007），然而，是否还存在其他能与SPT相互作用的蛋白还需进一步的研究。

近年来国内外的学者在拟南芥的雌蕊发育调控机制方面接连取得重大进展。这为其他作物，尤其是瓜果蔬菜等经济类作物的研究带来了便利（蒋励和张小兰，2013）。本试验从结球甘蓝中克隆得到甘蓝雌蕊调控转录因子SPT基因并对其蛋白进行体外原核表达检测，可得到纯化的pET43.1a-BoSPT融合蛋白且目标条带准确清晰。表明SPT能在体外表达。下一步将对SPT基因所表达的蛋白与其他蛋白的相互作用进行进一步的研究，更加深入地了解SPT基因调节雌蕊发育的分子机制。为全面了解甘蓝开花调控机制，并通过分子生物学方法来调控结球甘蓝的雌蕊发育使达到生产、育种目标奠定了理论基础。

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Moclecular Cloning and Sequence Analysis of SPTgene Transcription Factor Regulation of Pistil from Cabbage

YANG Pu-li，XU Jun-qiang，LIU Zhi-yu，WANG Zhi-min，ZHANGdan-hua，TANG Qing-lin*，SONGming*
（College of Horticulture and Landscape Architecture，Southwest University，Key Laboratory of Horticulture Science for Southernmountainous Regions，Ministry of Education，Key Laboratory of Olericulture，Chongqing400715，China）

Taking cabbage（Brassica oleracea L.） E1 asmaterials，We extracted total RNA from capullo，reverse transcribed cDNA. According to SPTgene sequence of Arabidopsis，primers weredesigned and1085 bp SPTgene with1062 bp open reading frame（ORF）was cloned by homology cloning techniques. Thededuced BoSPT protein contained353 amino acids，with amolecular weight of37.67 kD and pI of6.83. Afterdouble enzyme of EcoRI and KpnI restriction enzymes，and then construct the recombinant plasmids pET43.1a-BoSPT. After transformation to E. coli Rosetta （DE3），the expression of recombinant proteins weredetected via SDS-PAGE. The structural analysis of BoSPT though Smart-embl showed that it contained bHLH familydomain，which located at the position of173-221 amino acid residues，The phylogenetic tree indicated that the BoSPT had closegenetic relationship with AtSPT and AlSPT. Prokaryotic expression showed that themolecularmass of BoSPT protein was purified.

Cabbage；Pistil；SPT；Moclecular cloning；Sequence analysis

S635.1

A

1000-6346（2013）20-0024-08

2013-06-22；接受日期：2013-08-14

国家重点基础研究发展计划项目（2012CB113900），国家自然科学基金项目（31000908），重庆市自然科学基金项目（2011BA1002），中央高校基本科研业务费专项（XDJK2012B020），国家大学生创新项目（201210635045）

杨朴丽，女，专业研究生，专业方向：蔬菜遗传育种与生物技术，E-mail：yangpuli2008@163.com

*通讯作者（Corresponding authors）：汤青林，男，副研究员，硕士生导师，专业方向：蔬菜遗传育种与发育调控，E-mail：swutql@163.com；宋明，男，教授，硕士生导师，专业方向：蔬菜遗传育种与生物技术，E-mail：swausongm@163.com