田小强，王徐溢，常立功，吴鹏，蔡云朗，龙启强，黄培林

(1.东南大学医学院，江苏南京 210009;2.东南大学附属第二医院，江苏南京 210003)

锌-α2-糖蛋白(zinc-α2-glycoprotein，ZAG)是1961年由人类血清中提纯获得［1］的脂肪因子，由于它有较强的促进脂肪分解的作用，因此被认为是一个调节体重的候选基因［2］。Hale等［3］研究发现，前列腺癌患者中ZAG低表达多提示肿瘤分化不良，并且ZAG低表达的患者表现出较强的癌症转移潜能，因此推测ZAG具有抑制肿瘤增殖的能力［4］。这些研究提示我们，ZAG可能具有抑癌基因的特点，而目前该方面的研究内容较少。本研究利用ZAG过表达质粒，通过转染结直肠癌细胞株LoVo，从体外水平初步探究ZAG对大肠癌LoVo细胞的生物学行为的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

结直肠癌细胞株LoVo(购自上海细胞生物研究所)，ZAG表达质粒pGCMV/EGFP/Neo/ZAG、对照质粒空载体 pGCMV/EGFP/Neo(购自上海吉玛技术公司)，罗氏转染试剂X-tremeGENE HP，ZAG抗体(购自美国SANTAN公司)、Transwell 24孔板(美国Costar公司)，基质胶Matrigel(美国BD公司)，RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青公司)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(申能博彩)，SP法免疫组化试剂盒及DAB显色液(北京中杉金桥)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染

1.2.1.1 细胞培养 结直肠癌细胞株LoVo在37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，培养液为含10%小牛血清、1 ×105U·L－1青霉素和 1 ×105U·L－1链霉素的RPMI-1640。待生长至对数期时，用0.25%胰酶消化细胞进行后续实验。

1.2.1.2 转染及筛选 取对数生长期的LoVo细胞，调整浓度为2×105ml－1，以每孔2 ml接种于6孔板中培养，待细胞贴壁至70%时用X-tremeGENE HP进行转染。转染前将质粒(pGCMV/EGFP/Neo/ZAG以及pGCMV/EGFP/Neo)、转染液以及无血清的 RIPM-1640放置室温15 min，然后用无血清的RIPM-1640培养液稀释质粒到浓度为 0.01 μg·μl－1，取 400 μl质粒稀释液与12 μl转染液混合(质粒与转染液比为1∶3)，室温放置15 min。弃去6孔板中的培养液，加正常培养液2 ml·孔－1，加入相应RIPM-1640+质粒+转染液混合液，12 h后弃去原液，换含新鲜培养液继续培养1 d，然后用含 G418 600 μg·ml－1的 RPMI-1640 培养液培养进行筛选，两周后收集G418抗性细胞。

1.2.1.3 细胞分组 将无转染的LoVo细胞以及转染后的LoVo细胞分为3组，分别为空白对照组(LoVo组)、ZAG过表达组(pGCMV/ZAG-LoVo组)以及空载质粒组(pGCMV/LoVo组)，后续实验均按照此3组同步进行。

1.2.2 免疫组化检测ZAG的表达情况

将各组LoVo细胞制成单细胞悬液接种于已消毒的6孔培养板中的盖玻片上，于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养24 h，取出盖玻片，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定30 min。免疫组织化学方法根据试剂盒要求操作进行，然后进行DAB显色、复染以及脱水、封片，镜下观察。结果判断:细胞浆显现棕黄色者为阳性。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖力

各组LoVo细胞按照3×104孔－1细胞数接种到96孔培养板中，分别培养1、2、3 d，每天取出1块96孔培养板，采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴 盐 (四 唑 蓝，Multiply-table tournament，MTT，570 nm)比色法检测结肠癌细胞LoVo的增殖程度。每组设4个复孔，取平均值，绘制增殖曲线。

1.2.4 平板克隆形成实验

将各组LoVo细胞于培养瓶中反复吹打，使细胞充分分散，然后接种于6孔培养板中。每孔3 ml的RPMI-1640培养液含100个LoVo细胞，以十字方向轻轻摇动6孔板，使细胞分散均匀。在37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养2周，期间适时更换培养液。2周后弃去培养液，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定30 min后 PBS冲洗5 min，Giemsa染液染色10 min，PBS缓慢洗去染液。实验重复3次，计算每组细胞的克隆形成率，计算方法如下:克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

1.2.5 Transwell侵袭实验

实验前用无血清的RPMI-1640饥饿培养小鼠成纤维NIH3T3细胞24 h，收集上清液，里面含有趋化因子，可诱导肿瘤细胞穿孔向下生长。将Matrigel胶置于冰上过夜融化，与无血清的RPMI-1640以1∶3体积混合。取50 μl混合液加入Transwell上室聚碳酸脂膜上，十字形轻轻摇晃，使之均匀平铺于膜上，置于37℃细胞培养箱中30 min后取出。小室下方加入600 μl含趋化因子的3T3细胞培养液，小室内加入1×105个肿瘤细胞，培养箱中培养24 h。取出后用棉签将膜上的Matrigel胶拭去，梯度酒精固定，双蒸水冲洗，苏木素染色5 min，流水冲洗，伊红染色30 s，流水冲洗，晾干，镜下观察。200倍光镜下随机计数5个视野内的穿过膜的细胞数，以穿过小孔的细胞相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 荧光显微镜观察转染效率

荧光显微镜下可见，pGCMV/ZAG-LoVo在转染12 h后其荧光细胞数目为总细胞数目的70% ～80%，转染效率高(图1)。

图1 观察LoVo细胞转染效率Fig 1 The observation of transfection efficiency on LoVo cell

2.2 转染后ZAG的表达

免疫组化实验结果(图2)显示:LoVo组、pGCMV/LoVo组肿瘤细胞的 ZAG细胞呈阴性表达，而pGCMV/ZAG-LoVo组的肿瘤细胞呈阳性表达，其胞浆可见棕黄色信号。这些结果说明，pGCMV/EGFP/Neo/ZAG转染LoVo细胞后，增加了LoVo细胞ZAG的表达。

图2 免疫组化检测各组ZAG的表达情况Fig 2 The expression of ZAG with immunohistochemistry in each group

2.3 ZAG对直肠癌细胞株LoVo增殖力的影响

如图3所示，在24 h及48 h时，各组细胞间的生长速度没有明显的统计学差异(P＞0.05)。72 h时，pGCMV/ZAG-LoVo组与其余两组差异有统计学意义(P ＜0.05)。

图3 ZAG对直肠癌细胞株LoVo细胞增殖的影响Fig 3 The affect of ZAG on cell proliferation in cancer cell line LoVo

2.4 ZAG对直肠癌细胞株LoVo克隆形成能力的检测

细胞经2周培养结果显示，pGCMV/ZAG-LoVo组的克隆形成能力明显降低(图4 C)，与LoVo组和pGCMV/LoVo组比较差异有统计学意义(图4 D，P＜0.05)。LoVo经转染过表达的ZAG后，其克隆形成能力显著受到抑制。

图4 ZAG对直肠癌细胞株LoVo克隆形成能力的影响Fig 4 The affect of ZAG on colony forming ability in cancer cell line LoVo

2.5 ZAG对直肠癌细胞株LoVo侵袭力的影响

实验结果显示，pGCMV/ZAG-LoVo组与LoVo组、pGCMV/LoVo组比较，细胞的侵袭能力变弱(图5 C)，而LoVo组和pGCMV/LoVo组比较，细胞穿过基底膜的细胞数目差异无统计学意义(图5 D，P＞0.05)。此结果提示，ZAG能够有效抑制细胞的侵袭能力。

图5 ZAG对直肠癌细胞株LoVo侵袭能力的影响Fig 5 The affect of ZAG on invasion ability in cancer cell line LoVo

3 讨 论

大多数肿瘤组织的恶性表型与特殊的物质代谢和能量代谢密切相关，如乳腺癌、胰腺癌、大肠癌、前列腺癌等，其代谢异常不仅涉及到供能物质(如糖、脂肪、氨基酸等)的变化，也见于构成细胞的结构物质(如类脂、糖脂、糖蛋白、核酸等)的改变。大肠癌是最常见的恶性消化道肿瘤，物质代谢异常作为大肠癌明确的前期诱导因素之一与其发生、发展密切相关［5-6］。前期研究发现，AZG在胰腺癌中由于它的启动子组蛋白去乙酰化而广泛缺失，且通过AZG的沉默表达发现它能够导致上皮间质转分化标记物如波形蛋白和整联蛋白5的表达增加，而上皮标志物如钙黏蛋白1CDH1、桥粒蛋白和角蛋白则表达减少，且能够显著增加胰腺癌细胞侵袭性［7］。这些研究结果推测，AZG可能在调节EMT和胰腺癌的侵袭中非常重要，它可能是一个潜在的抑癌基因。我们的研究结果同样显示，转染了ZAG过表达的结直肠癌细胞株LoVo，其增殖能力受到明显抑制，且克隆形成能力和细胞的侵袭能力均受到抑制，提示ZAG的表达能够明显抑制直肠癌细胞株LoVo的恶性生物学表型，从而达到抑制肿瘤生长的作用。目前对于ZAG的研究主要集中在其脂肪代谢调节因子的功能方面，而其在癌症中作用机制的研究较少。本研究初步阐明了ZAG可能具有的抑制癌作用，但是其具体详细的作用机制还需要进行深入研究，以期能够进一步阐明AZG在大肠癌发生发展中所起的作用。

［1］BURGI W，SCHMID K.Preparation and properties of Zn-alpha 2-glycoprotein of normal human plasma［J］.J Biol Chem，1961，236(4):1066-1074.

［2］龚凤英，邓洁英.锌α2糖蛋白——一种新型的脂肪代谢调节因子［J］.国际内科学杂志，2007，34(5):297-300.

［3］HALE L P，PRICE D T，SANCHEZ L M，et a1.Zinc alpha-2-glyco—protein is expressed by malignant prostatic epithelium and may serve as a potential serum marker for prostate cancer［J］.Clin Cancer Res，2001，7(4):846-853.

［4］DESCAZEAUD A，TAILLE Y，ALLORY，et al.Characterization of ZAG protein expression in prostate cancer using a semi-automated microscope system［J］.Prostate，2006，66(10):1037-1043.

［5］PISCHON T，LAHMANN P H，BOEING H，et al.Body size and risk of colon and rectal cancer in the European Prospective Investigation Into Cancer and Nutrition［J］.J Natl Cancer Inst，2006，98(13):920-931.

［6］马爱迪，王彩莲，闵捷，等.血清脂质水平与结直肠癌远处转移的相关性分析［J］.东南大学学报:医学版，2012，31(4):471-473.

［7］ KONG B，MICHALSKI C W，HONG X，et al.AZGP1 is a tumor suppressor in pancreatic cancer inducing mesenchymalto-epithelial transdifferentiation by inhibiting TGF-β-mediated ERK signaling［J］.Oncogene，2010，29(37):5146-5158.