尤 宏，吕丽娜，赵雪松，王树涛

(哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室，150090哈尔滨)

纳米材料因其纳米尺度和纳米结构而具有优越的磁性、导电性、反应活性、光学性质而广泛应用于各种商业产品如电子器件、体育器材、防晒霜及医学领域中［1］.纳米材料在生产及使用过程中能通过各种途径进入环境.研究表明，涂料中的纳米TiO2经雨水冲刷可进入水体［2］，同时纳米颗粒可在废电池回收过程中被释放［3］.纳米材料在环境中经水、土壤、大气间的相互转化后最终可能在水生生物体内蓄积，通过饮食、呼吸、皮肤接触，危害人类及生物的健康.纳米颗粒可引起生物的发育毒性［4-5］、氧化应激［6］、生殖毒性［7］与呼吸毒性［8］.纳米ZnO能破坏抗氧化防御系统，诱导产生大量的活性氧，引起机体氧化应激损伤［9］.碳纳米管水溶液可对彩虹鳟鱼呼吸系统产生毒性，加快呼吸速率，1～2周持续暴露后引起心血管系统缺陷，最终导致死亡［8］.目前对发育毒性的研究相对有限，Bai等［10］研究表明纳米ZnO在暴露质量浓度为1～25 mg/L时，可延迟胚胎孵化，减少幼鱼体长，暴露96 h后引起尾部畸形.

斑马鱼作为模式生物具有生物个体小、易存活、胚胎透明、对水质污染与毒性物质反应灵敏等优点［11］.鉴于孵化率及畸形率是生长发育的重要指标，同时，纳米材料对这两个重要指标的考察目前没有得到系统性结论，且毒性作用机制尚不明确，选用斑马鱼胚胎为受试生物，研究环境中广泛存在的典型纳米材料——纳米ZnO、纳米TiO2以及碳纳米管急性暴露对斑马鱼胚胎孵化率和畸形率的影响，为评判纳米材料对水生生物的毒性效应提供基础数据，并为系统地评价典型纳米材料对环境生物及人体的生态风险提供理论依据.

1 实验

1.1 实验材料

纳米ZnO(粒径＜100 nm)、纳米TiO2(粒径20～40 nm)均购自Sigma公司，碳纳米管分散液(粒径20～40 nm)购自深圳市纳米港有限公司，其他试剂均为国产分析纯试剂.

斑马鱼购自武汉水生所，选当年生成年斑马鱼，平均体长3～4 cm，平均体质量0.30 g.在本实验室(28±1)℃条件下，于循环养殖系统中驯养20 d以上，选择体形正常、鱼鳞和鳍无破损、游动灵活、捕食敏捷的成熟亲鱼进行交配，以便收集鱼卵.

1.2 实验方法

每种纳米材料均设5个不同质量浓度，同时设空白对照，每个质量浓度均设3个平行.纳米ZnO用营养液(64.75 mg/L NaHCO3，5.75 mg/L KCl，123.25 mg/L MgSO4·7H2O和294 mg/L CaCl2·2H2O)配置成质量浓度为1，5，10，20，50，100 mg/L染毒溶液，碳纳米管和纳米TiO2也分别用营养液稀释成10，20，40，60，100 mg/L暴露质量浓度.

为了考察Zn2+溶出的影响，根据测定的不同质量浓度下纳米ZnO中融出的Zn2+质量浓度，配置孵化液，进行了Zn2+的对照实验.

在体式解剖镜下挑选发育正常的受精卵进行实验，选用直径为12 cm的结晶皿作为实验器具，每个结晶皿中放200 mL的纳米材料暴露液，100颗发育正常的受精卵，在受精卵产出后2.5～3.0 h(囊胚期初期)进行暴露实验，将结晶皿放在28℃的恒温水浴锅中培养.暴露实验每24 h更换1次染毒溶液，以保证实验水中溶解氧和实验前后溶液质量浓度相对稳定.统计并记录暴露后36、48、60、72、96 h等时段斑马鱼胚胎孵化情况，未孵化的鱼卵用虹吸管吸出.因纳米材料极易团聚，每次更换溶液前对纳米材料超声30 min.

1.3 分析与表征

采用扫描电子显微镜SEM(MX2600FE，英国Camscan公司)和透射电子显微镜TEM(JEM-2100，日本电子公司)对纳米材料进行表征.

采用电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS(X7，美国Thermo公司)测定ZnO溶出的Zn2+质量浓度.将配置好的纳米ZnO染毒溶液静止24 h，100 000转离心30 min后取上清液，用ICP-MS测定得出1，5，10，20，50，100 mg/L纳米ZnO溶出的Zn2+质量浓度分别为0.59，2.25，1.51，3.96，3.1和2.37 mg/L.

1.4 数据处理

实验结果表示为平均值±标准误差，每个质量浓度重复做3次.采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析，用卡方检验和t-检验判断实验组与对照组是否存在差异统计学意义，P＜0.05表示差异有统计学意义.

2 结果和讨论

2.1 纳米材料的表征

采用SEM表征纳米材料的表观形貌，结果如图1所示.可以看出:纳米ZnO呈多边形、不规则形状;纳米TiO2呈长条立体状;碳纳米管呈明亮条状，且相互交织.TEM表征得出材料粒径均在纳米尺度范围内，与厂商提供粒径基本一致.

2.2 纳米ZnO和Zn2+对斑马鱼胚胎孵化率影响

纳米ZnO和Zn2+对斑马鱼胚胎96 h孵化率的影响如图2所示.1，5，10，20，50，100 mg/L纳米ZnO暴露组对应的孵化率分别为88%，75%，56%，53%，46%，25%，随着暴露质量浓度的增加，孵化率下降显著，且与暴露质量浓度呈现一定的剂量效应关系.为考察纳米ZnO溶出的Zn2+对孵化率是否有影响，根据1.3 ICP-MS测定的结果，设置系列Zn2+溶液的暴露组(0.59，2.25，1.51，3.96，3.1，2.37 mg/L)，得出Zn2+暴露对应的孵化率分别为92%，89%，82%，79%，73%，75%.表明斑马鱼胚胎的孵化率虽然随着Zn2+暴露质量浓度的增加而有所下降，但较对照组变化不显著，且同等暴露质量浓度下，纳米ZnO暴露组孵化率明显低于Zn2+暴露组孵化率.由此可推断，纳米ZnO对胚胎孵化率有抑制作用，虽然Zn2+有溶出，但对孵化率没有显著影响.

图1 纳米材料的电镜表征图

图2 纳米ZnO和Zn2+对斑马鱼胚胎96 h孵化率的影响

图3、4阐明了斑马鱼胚胎在36～96 h的累积孵化率.由图3可见，斑马鱼胚胎48 h开始孵化，96 h全部孵出，在52～72 h(10～100 mg/L)暴露组，斑马鱼胚胎孵化速度显著变慢，有孵化延迟的现象.由图4可见，暴露质量浓度增加后，Zn2+暴露组胚胎孵化率同样有下降趋势.图3、4表明，在相同暴露质量浓度下，纳米ZnO的累积孵化率显著低于Zn2+，更直接地证明了Zn2+虽与纳米ZnO的孵化抑制效应有关，但是不起主要作用.纳米ZnO导致斑马鱼胚胎孵化抑制可能是胚胎暴露在纳米ZnO中后，纳米级的ZnO会进入胚胎的绒毛囊，从而将绒毛囊堵塞，导致胚胎不能正常分泌孵化酶和诱发组织缺氧所致.

图3 纳米ZnO对斑马鱼胚胎累积孵化率的影响

图4 Zn2+对斑马鱼胚胎累积孵化率的影响

纳米ZnO暴露组的斑马鱼胚胎出现心包水肿及卵黄囊水肿的畸形现象(图5)，水肿是斑马鱼胚胎心血管系统缺陷所致.由图6可以看出，随着暴露质量浓度的增加，水肿出现的几率增大，呈现一定的剂量依赖性.50及100 mg/L纳米ZnO暴露，斑马鱼幼鱼水肿率为5%及6.5%，且7%左右的水肿胚胎4～7 d后死亡，表明心血管系统也是纳米ZnO毒物作用的主要靶器官.

图5 斑马鱼胚胎水肿图片

图6 纳米ZnO对斑马鱼胚胎水肿率的影响

2.3 碳纳米管对斑马鱼孵化率的影响

碳纳米管对斑马鱼孵化的存活率影响很小.如图7所示，斑马鱼胚胎暴露于不同质量浓度碳纳米管溶液中96 h后基本全部孵出，未发现死亡或畸形等现象.由斑马鱼胚胎的累积孵化率(图8)可以看出，在40，60，100 mg/L等高质量浓度暴露组，斑马鱼孵化率与对照组相比显著延迟，且随着暴露质量浓度的增加，孵化延迟效应显著加强，存在剂量依赖效应，孵化延迟现象基本出现在52～76 h.

图7 碳纳米管对斑马鱼胚胎96 h孵化率的影响

实验结果显示，导致斑马鱼胚胎延迟孵化的主要原因是碳纳米管成团聚集并吸附在卵膜外层，改变卵壳弹性并妨碍氧向胚胎组织内传输，使组织处于缺氧状态，最终导致胚胎孵化延迟.目前对于碳纳米材料延迟胚胎孵化的机理还不清楚，有待进一步研究.

图836 ～96 h内碳纳米管对斑马鱼胚胎累积孵化率影响

2.4 纳米TiO2对斑马鱼孵化率的影响

如图9所示，暴露组斑马鱼胚胎96 h孵化率与对照组差异无统计学意义，表明急性暴露纳米TiO2不影响斑马鱼的孵化率.图10表明，大部分胚胎在48～60 h孵化，不同暴露组间差异无统计学意义.每组孵化胚胎在纳米TiO2暴露过程中存活率为100%，并且没有畸形现象出现，表明在本实验质量浓度下的纳米TiO2急性暴露对斑马鱼胚胎的存活率与畸形率没有显著影响.其他研究也得到类似的结论［4，12-13］.

有研究表明腮是纳米TiO2对鱼类作用的靶器官.本实验中纳米TiO2未能影响斑马鱼胚胎孵化可能是由于卵壳的保护作用.因此，低质量浓度暴露纳米TiO2从胚胎至发育成熟，对全生命周期的斑马鱼发育毒性以及组织特异性有待进一步研究.

图9 纳米TiO2对斑马鱼胚胎96 h孵化率的影响

图1036 ～96 h纳米TiO2对斑马鱼胚胎累积孵化率的影响

3 结论

1)不同纳米材料对斑马鱼的发育毒性不同，纳米ZnO主要影响斑马鱼胚胎孵化率，虽然Zn2+有溶出，但对孵化率没有显著影响.纳米ZnO还可引起斑马鱼胚胎水肿，且水肿率与暴露质量浓度存在浓度剂量效应关系.

2)碳纳米管溶液和纳米TiO2不影响斑马鱼胚胎96 h孵化率和存活率，但碳纳米管可使斑马鱼胚胎短期的孵化延迟.在同等实验条件下，暴露质量浓度越高，孵化延迟现象越显著.纳米TiO2和碳纳米管在暴露时间内对斑马鱼胚胎没有致畸效应.

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