林黛琴 万承波 王婷婷

(江西省产品质量监督检测院，江西 南昌 330029)

1 引言

豆芽是老百姓餐桌上最普通不过的蔬菜，风味独特，清香脆嫩，深受人们喜爱，它被当今世界称之为“天然和健康”食物引领风骚者之一，在国外也非常流行。在欧洲、美洲、亚洲的许多国家都有豆芽的专门制造厂，但在我们国家还存一些小作坊，小商贩的豆芽加工企业，而有些商贩为降低成本，提高利润，在豆芽生产过程中非法添加植物激素6－苄氨基嘌呤等促生长剂。6－苄氨基嘌呤是一种广谱植物生长调节剂，可显著促进柑桔保花保果及幼果生长，打破再生芽休眠等［1］，但从食品安全的角度来看，植物生长促进剂和其他农药一样，也有一定的毒性［2］。

随着植物生长促进剂的广泛应用，滥用及施用不当导致的食品安全问题逐渐增多，它的残留问题也引起社会的重视［3］，但对其限量标准的研究却较少［4］。因此进行食品中植物生长促进剂的残留分析研究很有必要，另也有助于更好地研究其在植物体内的代谢、降解和作用机制。目前6－苄氨基嘌呤的检测方法主要有紫外分光光度法［5］和高效液相色谱［6－7］，但豆芽中 6－苄氨基嘌呤高效液相色谱－串联质谱测定方法报道较少。本实验采用HPLC－MS/MS技术，对样品前处理过程进行了简化，建立了豆芽中6－苄氨基嘌呤的定性和定量分析方法。该技术具有检测限低，灵敏度高、准确可靠等优点，该法简便易行，准确可靠，可降低检测成本，节省分析时间，适于生产质量控制。

2 实验部分

2.1 仪器

Agilent6410A液相－串联质谱联用仪(美国Agilent公司)配有agilent1200高效液相色谱仪及电喷雾离子源，Milli－Q超纯水器 (美国 Millipore公司)，IKA T25均质器(德国IKA公司)，SI Vortex Genie 2漩涡混合器(美国Scientific Industries公司)，KQ－600DE型数控超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，SIGMA 3－18K低温离心机(德国SIGMA公司)。

2.2 试剂

6－苄氨基嘌呤(纯度＞98%，德国Dr.Ehrenstorfer公司)，甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)，甲酸(色谱纯，美国TEDIA公司)，乙酸(色谱纯，美国TEDIA公司)，Milli－Q 超纯水、0.1%甲酸水溶液(体积分数)、0.1%甲酸甲醇溶液(体积分数)、酸化甲醇(0.05%乙酸)。标准工作液系列:0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、10.0、20.0 μg/L。

2.3 实验条件

2.3.1 色谱条件 色谱柱:资生堂MGⅡ－C185 μm 2.1 mm ×150 mm，进样量:5 μL ，柱温:35 ℃，流速:0.3 ml/min，流动相 A:0.1%甲酸甲醇，流动相B:含0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

3.00 56 44 0.303.25 56 44 0.304.5 50 50 0.308.00 50 50 0.30

2.3.2 质谱条件 ESI(+)离子源:雾化气太压力:45psi、毛细管电压4000V、离子源源温度100℃;脱溶剂气温度:350℃;脱溶剂气流量:8L/min。6－苄氨基嘌呤的监测离子对、保留时间、解离电压和碰撞能量列于表2。

表2 6－苄氨基嘌呤质谱分析优化参数

2.4 样品制备

称取200 g豆芽样品，破碎均匀，然后称取5 g(精确至0.01 g)固体样品置于50 ml离心管中，均质1min，准确加入10 ml酸化甲醇，涡旋1 min后，超声提取30 min，于4℃ 6000 r/min冷冻离心机中离心5 min，移取酸化甲醇层到另一离心管中，残渣用10 ml酸化甲醇再次提取，合并有机相，定容至25 ml容量瓶中，从中取2.5mL用50%甲醇水稀释到25mL，取适量过0.22μm聚四氟乙烯膜，直接上LC－MS/MS测定。

3 结果与讨论

3.1 高效液相色谱条件的优化

分别对资生堂 MGⅡ C18柱5μm 2.0mm ×150 mm和 ZORBAX Eclipse XDB － C18 柱 3.5μm 2.1 mm×100 mm，两种不同高效液相色谱柱进行了比较，资生堂MGⅡ C18柱5μm 2.0mm ×150 mm色谱柱从分离度、峰形方面都比较理想，因此本文选择了MGⅡ C18柱5μm 2.0mm ×150 mm高效液相色谱柱。在对6－苄氨基嘌呤液相色谱串联质谱检测方面研究中，为了优化流动相，我们考察了不同体系当流动相:5mmol乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)－甲醇、水(含0.1%甲酸)－甲醇、水(含0.1%甲酸)－乙腈、水(含0.1%甲酸)－甲醇(0.1%甲酸)的色谱效果，实验表明，水(含0.1%甲酸)－甲醇(0.1%甲酸)做为流动相并采用梯度洗脱时，分析目标物的分离度和灵敏度较高，因此选择了该体系作为实验的流动相(梯度洗脱条件见表1)。

3.2 质谱定量定性

根据6－苄氨基嘌呤分子结构的特征，实验选用电喷雾正离子(ESI+)电离模式对0.1mg/L标准液进行Q1全扫描;并确定6－苄氨基嘌呤电离出的母离子，继续对其进行Q3全扫描，找出2个信号较强的碎片离子与母离子组成监测离子对:m/z 226/91.0(定量)、226/147.9(如图1所示)。继而以多反应监测模式优化了解离电压、碰撞能量等各种参数，优化后的参数见(表2)所示。

图1 6－苄氨基嘌呤标准溶液的多反应监测(MRM)色谱图

3.2 前处理条件优化

6－苄氨基嘌呤难溶于水，在甲醇和乙腈的溶解度较高，在酸、碱性条件下比较稳定，因质谱扫描方式选择了正离子扫描模式，所以考察了酸化乙腈、酸化甲醇、酸化甲醇水溶液、酸化乙腈水溶液四种不同提取溶液的提取效率进行了实验，实验结果表明提取率:酸化甲醇≈酸化乙腈＞酸化甲醇水溶液＞酸化乙腈水溶液态度。考虑到实验用的流动相为甲醇，且从实验安全角度来讲甲醇的毒性比乙腈小，因此本方法最终定酸化甲醇作为提取溶剂。

3.3 分析方法线性相关性及方法的检出限

在优化的液相色谱及质谱条件下，对一定范围浓度的标准溶液，在选定的条件下时测定，用质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制工作曲线见图2所示，在0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、10.0、20.0 μg/L 范围内呈良好的线性关系，相关系数(R2)为0.9996，线性方程:y=22477.7561x－1750.5236。样品经前处理后进行分析，得到方法检出限(信噪比 S/N=3) 为 2.2 μg/kg、方法的定量检出限7.3μg/kg(信噪比S/N=10)。

图2 6－苄氨基嘌呤工作曲线图

3.4 回收率、精密度实验及实际样品检测

采用上述的实验方法在豆芽样品添加6－苄氨基嘌呤标液做加标回收和精密度实验，分别添加了3个不同浓度水平的混合标准溶液，每个添加水平重复测定6次，计算回收率及精密度(以相对标准偏差表示)，3 个质量浓度的加标水平分别为:0.2、1.0、2.0μg/L，平均加标回收率和精密度结果见表3。剖析结果，本方法有良好的回收率和精密度满足痕量分析要求。

3.5 实际样品的测定

从菜市场随机选取4种豆芽进行分析，测定其中的6－苄氨基嘌呤残留量，其中2家豆芽检出了6－苄氨基嘌呤，残留量分别为7.5μg/kg和9.2μg/kg，表明确实存在一些不法企业无视国家有关规定，将6－苄氨基嘌呤用于豆芽加工生产中。阳性样品及样品加标色谱图见图3所示。

表3 6－苄氨基嘌呤的回收率、相对标准偏差及检出限(n=6)

图3 a阳性样品色谱图，b样品加标色谱图

4 结论

本实验建立了豆芽中6－苄氨基嘌呤植物生长促进剂残留的HPLC－MS/MS检测方法，该方法具有样品处理简单、测定周期短、灵敏度高及选择性强(质谱的监测模式为MRM，选择标准待测物的母离子所得到的两个定性子离子及保留时间来定性，选择性较好)、回收率稳定等优点，适用于大量样品的快速筛选、测定，同时也为执法机构的监督提供科学理论依据的技术支撑。

［1］张平，郝建军，于洋，等.GA3与6－BA复合剂对黃瓜产量的影响.沈阳农业大学学报［J］，2003，34(6):415－418.

［2］张莹;鹿毅;杨涛;张煌涛;李明;王吉德;高效液相色谱－串联质谱法测定果蔬中7种植物生长促进剂残留分析测试学报［J］，Journal of Instrumental A-nalysis，2012(04):629 －633.

［3］傅华龙，何天久，吴巧玉.植物生长调节剂的研究与应用.生物加工过程［J］，2008，6(4):7 －12.

［4］金芬，邵华，杨锚，王静.国内外几种主要植物生长调节剂残留限量标准比较分析.农业质量标准［J］，2007，(6):26 －27.

［5］张志斌，张晓滨.凯氏定氮法测定6－苄基氨基嘌呤的含量.河南化工［J］，2010(05):56－57.

［6］张莹;鹿毅;杨涛;张煌涛;李明;王吉德;高效液相色谱－串联质谱法测定果蔬中7种植物生长促进剂残留分析测试学报［J］，2012(04):629－633.

［7］杨途熙;魏安智;郑元;杨恒;杨向娜;张睿;高效液相色谱法同时分离测定仁用杏花芽中8种植物激素.分析化学［J］，2007(09):1359－1361.