华再东 ，刘西梅 ，毕延震 ，华 升，郑新民

(1 湖北省农业科学院，动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北 武汉 430064;2 武汉金鹰牧业有限公司，湖北 武汉 430209)

哺乳动物细胞核移植研究经历时间并不长，以1997年英国Roslin 研究所Wilmut 实验室“多利羊”的诞生为标志，揭开了体细胞核移植的序幕［1］.1998年，Wakayama 等［2］用颗粒细胞作供核细胞克隆出了小鼠.同年，Cibelli 等［3］得到第1 头体细胞转基因牛.但由于猪的特殊生殖特点，导致利用细胞核移植技术生产转基因猪的发展比较滞后，直到2000年，Polejaeva 等［4］才获得首例体细胞克隆猪.2003年，Sanghwan 等［5］克隆出了表达强荧光蛋白的转基因猪.Jagdeece 等［6］克隆出了敲除α-1，α-2 半乳糖苷转移酶基因的克隆猪，从而为人类培育异种器官移植猪跨进了一大步.在国内通过该技术路线获得了转基因山羊［7］和转基因牛［8］.冯秀亮等［9］得到了人体细胞和猪卵母细胞异种核移植囊胚.2005年8月中国农业大学李宁教授课题组获得我国第1 头体细胞克隆猪，我国也成为世界第7 个获得猪体细胞克隆后代的国家［10］.尽管体细胞核移植技术已在牛、羊、小鼠、猪等动物上获得成功，但总效率仍较低.而猪的体细胞核移植效率更低，体外成熟卵母细胞组成的重构胚发育至囊胚的比例在7%～10%，体内的为10%～31%，出生活仔数与移植胚的比率仅为1%左右［11］.绿色荧光蛋白(GFP)是一种水母蛋白，由于该蛋白可以在特定波长紫外光的激发下发出绿色荧光，因此可以作为标记蛋白.以绿色荧光蛋白为标记基因进行转基因动物研究可以使基因的检测更为简单，因此该基因成为转基因动物相关研究领域广泛应用的标记基因.为了完善克隆技术，优化猪核移植方法和胚胎激活方式，本研究使用转绿色荧光蛋白基因的胎儿成纤维细胞作为供体，比较了胞质内和卵周间隙注射方法、供体细胞处理方法及重构胚的融合/激活时间对转GFP 克隆胚早期发育的影响.

1 材料与方法

1.1 材料

DPBS 和TCM-199 为Gibco 公司产品，孕马血清促性腺激素(PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)为宁波激素制品厂产品;细胞培养相关耗材为NEST Biotech Co.，Ltd.产品，卵母体外成熟培养(IVM)以及胚胎培养4 孔板为Rochford Medical Ltd.产品.其他试剂如未特别注明，均为Sigma 公司产品.

卵母细胞体外培养液为改良TCM-199(mTCM199)，添加3.05 mmol/L 葡萄糖，0.91 mmol/L 丙酮酸钠，0.57 mmol/L L-半胱氨酸，1.00 mmol/L L-谷氨酰胺，10 ng/mL 表皮生长因子(EGF)，10 IU/mL hCG和10 IU/mL PMSG，75 μg/mL 青霉素，50 μg/mL 硫酸链霉素，体积分数为10%猪卵泡液(pFF);NCSU-23 +4 mg/mL BSA［12］.洗卵液用DPBS;脱卵液用质量分数为0.1%透明质酸酶.显微操作液为添加7.5 μg/mL 细胞松弛素B (CB)和4 mg/mL 牛血清白蛋白(BSA)的HEPES 缓冲的TCM-199;融合/激活液由0.25 mol/L 甘露醇，0.1 mmol/L 氯化钙，0.1 mmol/L氯化镁及0.5 mmol/L HEPES 组成;胚胎培养液为NCSU-23 +4 mg/mL BSA.

1.2 方法

1.2.1 猪胎儿成纤维细胞系的建立 从子宫内取出胎儿，含抗生素DPBS 清洗胎儿，转移到超净工作台内，用剪刀去除胎儿头，四肢，内脏，DPBS 冲洗;在直径100 mm 细胞培养皿内用剪刀将剩余部分剪碎，组织块大小为1 mm3，加入少许血清，将组织块转移到细胞培养瓶的底壁上;用弯头吸管将组织块均匀地铺开，将铺有组织块的一面向上，加入15 mL 细胞培养液，再放入39℃、相对湿度为100% 、体积分数为5% CO2培养箱;培养6～8 h 后，将铺有组织块的一面翻转过来，使细胞培养液浸没组织块;培养5 d后观察组织块周围有无细胞爬出，待细胞生长至80% 汇合时，进行传代培养或者冷冻保存.具体方法参考文献［13］.

1.2.2 猪胎儿成纤维细胞的转染和筛选 利用脂质体介导的方法将质粒pEGFP-C1 (Clontech)转染到猪胎儿成纤维细胞，即按照试剂盒LipofectamineTM2000 (Invitrogene)所附说明书进行转染:将传代2～5 次的细胞接种到6 孔培养板，待其在无抗生素的细胞培养液中汇合90%时进行转染，每孔加入500 μL 含4 μg pEGFP-C1 和10 μL LipofectamineTM2000并预先在室温孵育20 min 的无血清DMEM，混匀转染培养液，放入细胞培养箱，在39℃、体积分数为5%CO2、相对湿度为100%条件下培养6～8 h，再换用含体积分数为20%FBS、体积分数为1% NEAA 的高糖DMEM 培养.待细胞汇合90%时，将细胞消化后转至T-25，加入含0.6 mg/mL G418 的细胞培养液连续筛选14 d，Leica 显微镜下观察荧光细胞.

供体细胞准备方法:将传代5～10 次的细胞分为2 部分，一部分长至80%汇合时采取血清饥饿处理，即把细胞培养液FBS(Gibco)体积分数从20%降至0.5%继续培养3～5 d;另一部分细胞不饥饿，即用FBS(Gibco)体积分数为20%的细胞培养液培养8～10 d.按常规方法消化、离心，最后加1 mL 显微操作液重悬细胞沉淀备用.倒置显微镜选择呈绿色的细胞用作供体.

1.2.3 猪卵母细胞的采集和IVM 猪卵巢从当地屠宰场采集，摘取新鲜卵巢立即置于盛有26～37℃生理盐水(含青霉素20 万IU/L、链霉素15 万IU/L)的保温瓶内，2 h 内送回实验室，用适量生理盐水(26～37℃)冲洗3～5 遍，盛于500 mL 烧杯中，放在水浴锅(37℃)里.用镊子夹取卵巢，再用生理盐水润湿灭菌纱布包裹，采用10 mL 注射器(16 号针头)抽吸直径为3～8 mm 的卵泡，吸取的卵泡液汇集到置于37℃水浴保温的尖底灭菌试管中，静置15～20 min，弃上清液，取试管底部卵泡液于表面皿中，实体显微镜下观察，捡取卵丘卵母细胞复合体(COCs)，转移到DPBS 液滴中，冲洗3～5 遍，用CO2培养箱内平衡2 h 以上的mTCM199 培养基再洗3遍，然后放在39℃，相对湿度为100%，体积分数为5%CO2培养箱中培养.在体外培养的0～22 h 添加10 IU/mL PMSG 和hCG，22～44 h 不加激素.间隔24 h 调换约1/2～2/3 的培养液，并于倒置显微镜下观察卵丘细胞扩散状态.

1.2.4 猪卵泡液(pFF)制备 抽取卵巢上直径4～8 mm 的卵泡，将抽取液放入离心管中离心(1 600 r/min)20 min，取上清液于超净工作台内，以0.22 μm 滤膜过滤后分装于0.5 mL 离心管中，-20℃条件冷冻保存备用.

1.2.5 卵母细胞成熟观察及鉴定 COCs 培养44 h，在4×10 倍实体显微镜下观察，将卵丘扩散良好，胞质发育均匀的COCs 转移到质量分数为0.1%透明质酸酶溶液中，用移液器轻轻吹打脱去颗粒细胞，以第一极体排出作为卵母细胞成熟的主要标准.

1.2.6 注核 透明带下注射法.将一个供体细胞沿去核切口注入卵周隙，供体细胞的细胞膜与去核卵母细胞的质膜紧密接触;细胞质内注射法，将供体细胞直接注入到去核卵母细胞的胞质内.注射完成后检测卵母细胞质膜完整性，弃去裂解卵，对完整的存活卵进行激活操作.

1.2.7 重构胚胎的融合激活 将恢复好的重构卵分批转移到融合液中平衡3 min，洗涤3～5 遍后，每批5 个放入已经铺满融合液、电极宽度为1 mm 的融合槽(BTX ECM2001 电融合仪配套电激活槽)中，用自制口吸管使供体细胞-受体卵细胞膜接触面与电极平行，再用ECM2001 融合仪施加60 μs、1.2 kV/cm，2 次直流电脉冲诱导融合并同时激活，之后将经过电击的重构卵用NCSU-23 +4 mg/mL BSA 洗涤5 遍，立即转入矿物油覆盖的胚胎培养液中，在39℃、体积分数为5% CO2及相对湿度为100%条件下培养0.5～1 h 后判定融合.

1.3 数据分析

试验结果用卡方(χ2)检验，进行差异显著性分析.

2 结果与分析

2.1 表达绿色荧光蛋白细胞的筛选

利用脂质体介导的方法将质粒pEGFP-C1(Clontech)转染到猪胎儿成纤维细胞，经LipofectamineTM2000 筛选后的细胞在倒置荧光显微镜下观察，标记已表达绿色荧光蛋白的细胞克隆，于体视镜下将标记的细胞挑出，经传代、培养，即为下一步体细胞克隆的核供体细胞(图1).

图1 G418 筛选14 d 后的GFP 转基因猪胎儿成纤维细胞(20×)Fig.1 Transgenic pig fetal fibroblasts cells of transfected by GFP after 14 d

2.2 转基因体细胞核移植胚胎的体外发育及绿色荧光蛋白表达检测

融合的重构胚培养于NCSU-23 培养液中，于39℃、体积分数为5% CO2、相对湿度为100%的培养箱中培养48 h，荧光镜下观察细胞发育的卵裂数情况(含2 个及2 个以上卵裂球的胚胎).胚胎构建当天为第0 天，培养48 h 荧光镜下统计卵裂胚胎数(含2个及2 个以上卵裂球的胚胎)情况(图2).

图2 GFP 转基因体细胞核移植胚胎体外发育及绿色荧光蛋白表达结果(20×)Fig.2 GFP expression of transgenic pig somatic cell nuclear transfer embryo

2.3 供核细胞的不同处理方法对核移植胚胎分裂的影响

以胎儿成纤维细胞作供体细胞，分血清饥饿(用体积分数0.5%的FBS 培养3～5 d)与不饥饿培养10 d 处理组，采用卵周间隙注核，重构胚用NCSU-23为培养液四孔板法培养，2 组重构胚分裂率差异不显著(P＞0.05).详见表1.

2.4 注核方法对核移植胚胎的影响

采用胞质内和卵周间隙对42～44 h 卵母细胞进行注核操作，结果显示，胞质内注射重构胚的卵裂率(81.11%)与卵周间注核的卵裂率(76.80%)，差异不显著(P＞0.05).详见表2.

2.5 不同时间融合/激活对核移植重构胚分裂的影响

以胎儿成纤维细胞采用卵周间隙注射法构建重构胚，然后重构胚在不同时间进行融合/激活操作(分别在0～1、2～4 和6～8 h 进行)，再用四孔板法培养，培养液为NCSU-23.前2 组重构胚卵裂率显著高于第3 组(P＜0.05)，但前2 组之间无显著差异(P＞0.05).详见表3.

表1 供核细胞不同处理方法对核移植胚胎分裂的影响1)Tab.1 Effects of different treatments of donor cumulus cell on the cleavage rates of reconstructed embryo

表2 不同注射方式对克隆胚胎的体外早期发育影响1)Tab.2 Effects of field injection method on in vitro developmental competence of pig reconstructed embryos

表3 不同时间融合/激活对核移植重构胚分裂的影响1)Tab.3 Effects of different fusion/activation schedules on in vitro developmental competence of pig reconstructed embryos

3 讨论

绿色荧光蛋白是进行转基因研究的重要标记基因.制作转基因动物的前期工作中，可以将目的基因构件与GFP 基因串联起来一并整合，由于GFP 基因的表达产物在胚胎发育的早期即可检测到，可以只选择那些表达了GFP 的胚胎进行移植，这样即可以减少移植胚胎的盲目性.试验采用了简便易行的脂质体转染法，脂质体是介导DNA 进入细胞的重要试剂，由于其应用简单，效果稳定，现在已经成为非病毒载体转染细胞的主要转染手段.本试验通过G418对猪胎儿成纤维细胞转染后的筛选，形成表达绿色荧光的细胞克隆，经过挑选培养后用于核移植.理论上，以阳性体细胞为核供体经过核移植获得的胚胎，应该都是阳性胚胎.但是本试验发现并不是所有的胚胎都是阳性，这与文献中的结果相符［14-15］.原因可能是显微操作注核过程中并未打开荧光激发系统，直接挑取GFP 阳性细胞用于核移植;也可能由外源基因整合得不稳定造成，因此不可避免会导致非转基因细胞核移植胚胎的存在.

对供体细胞的选择和处理在整个核移植体系中非常重要，本试验比较了供核细胞的不同处理方法对核移植胚胎分裂的影响.结果显示以胎儿成纤维细胞作供体细胞，血清饥饿与非饥饿培养，核移植重构胚的卵裂率差异不显著.该结果与Wilmut 等［1］的相同.Edward 等［16］认为，克隆胚胎和胎儿损失与供体细胞血清饥饿有关，胎儿后期流产可能由于DNA被破坏或DNA 不当修复.因此，造成血清饥饿得到的克隆胎儿有某些先天的生理缺陷.不采用血清饥饿，重构胚的卵裂率并没有降低，这有可能避免克隆胚胎或移植胎儿早期流产.KuhhoIzer 等［17］研究也表明血清饥饿不能提高卵裂率和囊胚率.从目前研究状况可以看出，G0 期或G2/M 期的供核细胞都能有效地在胞质受体中进行正常核编程.然而，Fioretti等［18］认为没有一种伴随核移植动物出生的细胞周期专一性标记证明核移植的后代来源于某一特定时期.因此，对供体细胞的周期、供核与受体卵母细胞的发育同步及其最适周期的认识等问题，还需要做更深入的研究和探讨.

胞质内注射一般用压电-陶瓷系统(Piezo-actuation)微注射系统，直接把供体核注入胞质内［19］.笔者最初也使用Piezo 系统，但通过多次重复试验，发现Piezo 系统和斜口针注射的效率没有显著差异，而Piezo 系统操作过程中需要在针尖装汞和洗针比较麻烦.因此，本研究采用自制的斜口针，把整个供核细胞注入胞质内，不需要融合而且效果很好，其卵裂率达81.11%.这可能是由于胞质内注射的重构胚供体细胞与受体卵母细胞质膜接触更好，易于融合激活，有利于细胞重编程所致.也有研究认为，移入的供核细胞的细胞膜会逐渐在胞质受体中消失［20］，移入的胞质成分对重组胚的进一步发育很重要，确保了DNA 能完全进入去核的卵母细胞，避免为获得供体核过程中对供体核结构的损坏.因此，这样能更有效地支持重组胚的发育.虽然透明带下注射的效果不如胞质内注射好，但两者总体效率没有显著差异，而胞质注入法可将导入外源遗传物质的过程由两步简化成一步，缩短核移植操作时间，提高克隆效率，为控制克隆胚胎的活化时间以及调整其细胞周期提供了可能.

最早的融合方法使用仙台病毒［21］或PEG［22-23］介导融合，效果很不稳定而且毒性大，而Willadsen等［24］利用胚胎细胞克隆羊试验中采用的直流电介导融合的方法，简便而且高效，目前已被广泛使用.本研究发现将卵周间隙注射法构建重构胚在不同时间段进行融合/激活操作，结果表明在6～8 h 融合/激活卵裂率显著低于0～1 h 和2～4 h 组，虽然这2 组重构胚卵裂率无显著差异，但核移植胚胎后在2～4 h 内融合/激活的效果更好些.这可能是体外显微操作过程中，对卵母细胞造成一定损伤，而重构胚后放置2～4 h，使受到损伤的卵得到恢复，有利于重构胚的重编程，提高卵裂率.但延长激活时间是否能提高核移植效率，避免克隆胚胎或移植胎儿早期流产，还需进一步研究.

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