李竹英 王雪慧 刘文波 刘建秋△

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040）

止哮汤对支气管哮喘大鼠模型ERK1/2表达的影响*

李竹英1王雪慧1刘文波2刘建秋1△

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040）

目的 观察止哮汤对支气管哮喘大鼠模型ERK1/2表达的影响，探讨止哮汤治疗支气管哮喘的作用机制。方法 选取健康Wistar大鼠60只，随机分为正常对照组、模型组、地塞米松组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组。利用卵蛋白加氢氧化铝复制哮喘大鼠模型，末次激发24 h后处死大鼠，HE染色后光镜下观测病理学变化，观察免疫组化法检测肺组织中ERK1/2的含量。结果 正常对照组ERK1/2呈阴性表达，模型组ERK1/2呈强阳性表达，强于正常对照组；地塞米松组、中药各剂量组ERK1/2表达均弱于模型组；中药低剂量组强于地塞米松组；中药中、高剂量组则与地塞米松组无差异；中药中、高剂量组均弱于中药低剂量组；中药高剂量组与中药中剂量组表达无差异。结论 中药止哮汤可下调哮喘大鼠肺组织中ERK1/2的表达，高、中剂量组疗效较好，与地塞米松效果相当。

止哮汤 支气管哮喘 ERK1/2

气道重塑可导致不可逆的气道阻塞和持续性的气道高反应性，是目前难治性哮喘的重要病理基础之一。细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）通道是体内重要的细胞内信号转导通道，通过介导平滑肌细胞分泌细胞外基质成分，进一步参与气道重塑的发生和发展。本研究旨在观察止哮汤对支气管哮喘大鼠肺组织ERK1/2表达的影响，阐述止哮汤治疗哮喘的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物Wistar大鼠60只，购自哈尔滨医科大学第二附属医院实验动物中心，清洁级，体质量（230±20）g。实验前大鼠饲养在室温23℃，黑夜和白昼各12 h的环境中，适应性喂养3 d后用于实验。取材前禁食12 h，但不禁水。

1.2 试药与仪器鸡卵蛋白 （OVA，GradeⅤ，美国Sigma公司，规格 1 g）。止哮汤中药，组成：麻黄 12 g，川椒目 10 g，紫苏子 10 g，半夏 10 g，紫菀 10 g，炙米壳3 g，细辛5 g，甘草3 g。地塞米松磷酸钠注射液（1 mL，5 mg，天津药业集团新郑股份公司）。4%甲醛、石蜡、乙醇、苏木精、伊红。浓缩型DAB试剂盒（北京博奥森生物科技有限公司）及PV6001二步法免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）等。超声雾化器（上海鱼跃公司，A5253）；自制密闭有机玻璃箱 （50 cm×40 cm×25 cm）。

1.3 分组与造模60只实验大鼠随机分为正常对照组、模型组、地塞米松组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组共6组，每组10只。除正常对照组外，其余各组采用V级OVA制备模型，参照文献［1］的方法略作改进，分致敏和激发两阶段。分别于第1日和第8日腹腔注射共1 mL（含1 mg OVA和100 mg氢氧化铝凝胶）无菌抗原液致敏，第14日后将动物置于自制的密闭有机玻璃箱中，用雾化器将含1%OVA生理盐水溶液雾化吸入，每日1次，每次30 min，连续定时激发共14 d。正常对照组用相同体积的生理盐水代替OVA进行致敏和激发。

1.4 给药方法将止哮汤中药汤剂煎煮成42.5、85、170 g/100 mL，根据人与大鼠给药剂量比值1∶7，各剂量组分别予相应剂量，按1 mL/100 g体质量灌胃。中药各组在第2次致敏后第4日开始给予中药灌胃，激发阶段则每次激发前1 h给予中药灌胃。地塞米松组在第2次致敏后第4日开始给予地塞米松（0.1 mg/100 g体质量）灌胃，激发阶段则每次激发前1 h经腹腔注射地塞米松 （0.1 mg/100 g体质量）。各组均于末次激发24 h后处死。

1.5 标本采集及检测于末次激发24 h后，将动物用20%乌拉坦5 mL/kg腹腔注射麻醉，取右肺上叶置于甲醛中，HE染色后待测病理学变化。取左肺组织固定于4%多聚甲醛中，采用免疫组化方法（PV二步法）检测检测ERK1/2，用美国Universal Imaging Porporation的图像分析系统每个时间点选取3张，每张切片随机选取5个视野，应用Meta Morph软件分析阳性细胞的光密度。

1.6 统计学处理应用SPSS13.0统计软件。计数资料以（±s）表示，组间比较用 t检验。 P＜0.05为差异有统计学意义。多组间均数差异显著性检验用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 各组大鼠肺组织病理学改变正常对照组大鼠肺组织切片HE染色镜下观察：支气管及血管周围未见炎性细胞浸润、支气管管壁增厚及面积增大，无气道重塑现象。模型组大鼠肺组织镜下观察支气管上皮水肿、增厚、脱落、结构紊乱；杯状细胞及黏液腺增加，黏膜下层和平滑肌增厚；气道壁及气道、血管周围有大量炎性细胞浸润，基底膜轻度增厚且形态不规则，支气管平滑肌明显肥大，支气管管壁面积明显增大。各治疗组支气管黏膜增生，黏液分泌亢进，支气管周围有淋巴细胞及嗜酸粒细胞浸润，肺泡间隔增宽，部分有水肿，部分炎性细胞浸润，经组间比较，中、高剂量组与地塞米松组表达相当，低剂量则表达强于上3组。见图1。

2.2 各组大鼠肺组织中ERK1/2表达见表1。

表2 肺组织ERK1/2表达图像分析结果（±s）

表2 肺组织ERK1/2表达图像分析结果（±s）

与正常对照组比较，△P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05；与地塞米松组比较，▲P＜0.05；与中药低剂量组比较，#P＜0.05。

组 别 n正常对照组 10模型组 10地塞米松组 10光密度值10.53±2.27 45.96±5.21△23.75±3.69*中药低剂量组 10 30.25±2.16*▲中药中剂量组 10 23.12±4.37*#中药高剂量组 10 22.63±5.61*#

3 讨 论

气道重塑的改变包括上皮细胞增生，杯状细胞化生，气道平滑肌 （ASM）的增生和沉积的细胞外基质（ECM），而气道重塑的概念也仍以组织学描述为主，气道壁的增厚及气道壁横截面积增大，包括上皮下纤维化，平滑肌细胞的肥厚、增殖及黏液腺和杯状细胞的增生及分化。研究认为，这种不可逆性气道狭窄主要由气道平滑肌细胞异常引起：气道平滑肌细胞持续受到胞外信号（如激动剂、炎性递质、生长因子等）刺激后出现增生肥大和收缩，导致气流受限。ERK1、ERK2在导致气道平滑肌增殖的信号转导通路中发挥重要作用。有研究显示，Ras/Raf/ERK信号通路通过加快细胞周期、促进DNA复制，从而使ASMC细胞增生［2］，从而参与到气道重塑中。在多种生长因子、细胞因子、趋化因子等刺激下ERK通路被活化，引起并调节气道的上皮细胞、纤维细胞、平滑肌细胞的增殖、凋亡、介质及炎症因子、基因的表达等而共同参与气道重塑。

在本实验中，正常对照组ERK1/2呈阴性表达，而在模型组ERK1/2的表达呈强阳性，显著强于正常对照组（P＜0.05），提示ERK1/2信号通路在哮喘状态下被激活，免疫组化图片提示ERK1/2表达主要集中在支气管平滑肌细胞的胞浆，证明了ERK1/2参与气道重塑。模型组支气管平滑肌层ERK1/2呈强阳性表达，光密度值均显著高于地塞米松组和中药各组，结合光镜下哮喘大鼠肺组织支气管及血管周围炎性细胞浸润，表明在哮喘大鼠模型中存在着ERK1/2高表达，中药各组ERK1/2表达均弱于模型组，组间比较提示中、高剂量组弱于低剂量组，而中、高剂量组则表现相当，与HE染色镜下观察结果一致。地塞米松组ERK1/2表达较模型组明显减轻，与中药各组比较，弱于低剂量组，而与中、高剂量组相当，表明止哮汤中、高剂量在治疗大鼠哮喘模型中疗效与地塞米松相当，提示止哮汤可能是通过ERK1/2参与到治疗气道重塑中，起到部分抑制和逆转气道重塑的作用，从而达到治疗哮喘的目的。

止哮汤在临床中主要治疗哮证，冷哮型，在临床上治疗取得了较为满意的疗效［3］，为以温肺散寒、化痰平喘为法而组方的纯中药制剂。方中麻黄为君药，解表散寒。麻黄、细辛、半夏诸药相配，一散一温一燥，增强了化痰之功。细辛温肺化痰，半夏燥湿化痰，紫苏子降气平喘，紫菀温肺而化痰浊，诸药共为臣药，使湿邪得燥、逆气得降、水气得散、阴寒得温。佐以炙米壳敛肺止咳，又可防麻黄过于辛散，川椒目祛痰平喘。甘草既能调和诸药，又能化痰止咳和中，避免了君臣之药伤及肺胃之气，为使药。本方正是结合冷哮的病因“外感风寒之邪”与“内有宿痰伏肺”进行辨证施治立法，诸药合用，标本同治，共奏温肺散寒、化痰平喘之功效。

［1］苗会，薛全福，庄逢源，等.哮喘大鼠动物模型的制备［J］.基础医学与临床，1998，18（1）：72-80.

［2］Gerthoffer WT，Singer CA.MAPK regulation of gene expression in airway smooth muscle［J］.Respir Physiol Neurobiol，2003，137（2-3）：237-250.

［3］李竹英，王晶波，王雪慧，等.止哮汤治疗支气管哮喘急性发作期临床研究［J］.中国中医急症，2012，21（8）：1207-1208.

Effect of Zhixiao Decoction on ERK1/2 Expression of Bronchial Asthma Rat Models

LI Zhu-ying1，WANG Xue-hui1，LIU Wen-bo2，et al. 1 First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heiongjiang，Harbin 150040，China；2 Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150040，China

Objective:To observe the effect and the mechanism of Zhixiao Decoction on ERK1/2 expression of bronchial asthma rats model.Methods:60 wistar rats were divided randomly into the normal control group，the model group，the dexamethasone group，the TCM low-dose group，the TCM medium-dose group and the TCM high-dose group.After the rats models establised by the OVA plus aluminium hydroxide sensitized，the histopathologic changes and the ERK1/2 content were detected and compared among these groups.Results:ERK1/2 contents in the model group were higher significantly than that in the normal control group.These expressions in the dexamethasone group and the TCM groups were lower obviously than those in the model group.This content in the TCM low-dose group was higher remarkably than that in the dexamethasone group.There were no statistical significances among the TCM medium-dose group，the TCM high-dose group and dexamethasone group.The contents in the TCM medium-dose group and high-dose group were lower obviously than those in the ow-dose group.There was no obvious significance between the TCM medium-dose group and the TCM high-dose group.Conclusion:The Zhixiao Decoction can decrease ERK1/2 in lung of asthma rats.This effect of the TCM medium-dose group and the TCM high-dose group were better than those of other gorups.

Zhixiao Decoction；Bronchial asthma；ERK1/2

R285.5

A

1004-745X（2013）06-0874-03

教育部“春晖计划”资助项目（Z2009-1-15008）

△通信作者

2013-03-16）