张 毅 苗 玲 苏 敏 蔡 琰

上海交通大学医学院附属仁济医院神经内科 上海 200127

本文进一步分析硫辛酸对内源性抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）的影响，以探讨硫辛酸抗氧化、保护神经细胞的机制。

1 材料与方法

1．1 主要试剂和设备 硫辛酸（纯品原料）有上海现代制药有限公司提供，所用细胞株是美国新墨西哥洲洲立大学Davise教授馈赠的小鼠神经母细胞瘤细胞A2（NBA2）。高糖改良 Eagle培养基（DMEM）、0．25%胰蛋白酶（含 EDTA）、磷酸缓冲液（PBS）为美国invitrogen公司产品；牛血清白蛋白、胰岛素是Sigma公司产品；DMSO是AMRESCO公司产品；MTT和小牛血清购自上海华美生物公司；GSH分析试剂和考马斯亮蓝蛋白测定试剂购自南京建成生物工程有限公司。CO2细胞培养箱：TABAI MFG．有限公司（日本）；超净工作台：苏州净化设备厂（中国）；Nicon倒置相差显微镜：Nicon公司（日本）；Bio－Rad 680酶标仪：Bio－Rad公司（美国）；7200分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司（中国）。

1．2 培养液准备 牛血清培养液（BD）：DMEM中含小牛血清10%，pH 7．2，无血清培养液（AI）：DMEM 中含500mg牛血清白蛋白和5mg胰岛素，pH 7．2。含硫辛酸培养液（LA）：在AI中加入硫辛酸，配制成含100μmol／L硫辛酸的无血清培养液。

1．3 细胞培养 依据实验性神经细胞老化模型建立方法［1］，采用无血清培养液（AI）在96孔培养板和25cm2的细胞培养瓶中培养NBA2细胞。设立硫辛酸实验组（LA组）和无血清对照组（AI组），LA组培养液为含100μmol／L硫辛酸的AI培养液，2组均设5d、10d和15d时间组；细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养。

1．4 用MTT法检测神经细胞存活数 接种在96孔板中各组细胞（1．0×104个／孔）培养至5d、10d和15d时同时终止培养，各孔中加入新鲜配制的5mg／mL的MTT溶液20 μL，继续在37℃、5%CO2培养箱中孵育4h，然后去除溶液，每孔中加入150μL DMSO，震荡10min溶解结晶，最后在酶标仪上用570nm波长测定各孔的吸光度，吸光度的大小反映了存活的细胞数量。……