江勇 钱明 王威 陈涛 李海成 陈燕梅 卓文基 郭卉欣 周琳 钟球

·论 著 ·

卷曲霉素在罗氏培养基中的稳定性研究

江勇 钱明 王威 陈涛 李海成 陈燕梅 卓文基 郭卉欣 周琳 钟球

目的 检测卷曲霉素（Cm）在罗氏培养基中的稳定性，了解Cm在罗氏培养基中的降解速率；检测Cm降解对药物敏感性试验结果的影响。方法 用高效液相色谱仪分别检测4℃和37℃2种保存条件下，Cm在罗氏培养基中的稳定性；使用不同保存条件下的罗氏培养基进行药物敏感性试验，以验证Cm降解对敏感性试验结果的影响。结果 在4℃保存时，罗氏培养基中的Cm含量与时间呈反比，保存10 d时，罗氏培养基中的Cm降解2.04%，保存40 d时，Cm降解21.5%，保存80 d时，Cm降解41.7%，保存到200 d时，检测不到Cm的存在；在37℃保存10 d时，罗氏培养基中的Cm降解46.8%；在37℃保存30 d时，无法在罗氏培养基中检测到Cm的存在。在4℃存储时间为10～160 d的Cm罗氏培养基进行结核分枝杆菌药物敏感性试验（DST）时，MIC在0.8～1.0μg/ml菌株，在4℃存储时间为40 d的Cm罗氏培养基上生长6周后出现16个菌落。MIC在1.0～1.5μg/ml菌株，在4℃存储时间为40 d的Cm罗氏培养基上生长6周后出现阳性结果（十）。结论 Cm罗氏培养基在37℃保存时不稳定，在4℃保存时相对稳定，但存储时间不应超过40 d。

分枝杆菌，结核； 培养基； 微生物敏感性试验； 卷曲霉素硫酸盐； 色谱法，高压液相

结核病（tuberculosis）是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）通过空气传播感染的慢性传染病，是主要的国际公共卫生问题之一。据估计，全球每年大约有接近800万例感染结核病［1-2］。近年来结核病的总体发病率在下降，但是结核病耐药现象却逐渐变得严重［3-4］。不恰当的管理措施和治疗方案是导致耐药菌增加，以及耐药程度加重的主要原因［5］。目前，耐药结核病的诊断主要依赖于实验室的药物敏感性试验（DST）结果，DST是一个步骤很多的复杂性试验，对DST的结果造成影响的因素较多，本研究关注了含药培养基中药物稳定性对DST结果的影响，目的是了解含药培养基中药物不稳定性是否是DST不准确的一个原因，通过本研究对含药培养基有效期的确定提供实验室数据支持。

材料和方法

1.菌株及试剂：结核分枝杆菌H37Rv标准株（ATCC93009）来自中国药品生物制品检定所；9株结核分枝杆菌临床分离株由佛山市第四人民医院提供；卷曲霉素（Cm）购自于Sigma公司（美国）；硫酸卷曲霉素（用于HPLC方法学验证）购自于海正药业股份有限公司；甲醇、异丙醇为色谱纯，购自于Sigma公司（美国）。

2.主要设备：高效液相色谱仪（high performance liquid chromatograph，HPLC），L-6200三元泵，L-4200紫外检测器，655A-40自动进样器，655A-52柱温箱，D-2000色谱整合器购自于Hitachi公司（日本）。组织匀浆机购自于QIAGEN公司（美国）。

3.实验方法：用HPLC监测罗氏培养基Cm的浓度。硫酸卷曲霉素配制成最终浓度为90 mg/ml的内标液；取Cm罗氏培养基约0.5 ml加入1 ml的99.99%纯度的甲醇放在组织匀浆机中混匀；5000×g离心10 min，取上清液进行高效液相色谱分析。使用4℃存储时间为10、20、30、40、60、80、120、160 d 的Cm罗氏培养基进行比例法药敏试验。选择3株已知最低抑菌浓度（MIC）的结核分枝杆菌临床分离株进行比例法药敏试验：1株MIC＜0.05μg/ml；1株MIC在0.8～1.0μg/ml；1株MIC在1.0～1.5μg/ml。比例法DST根据WHO指南，在含40μg/ml Cm的罗氏培养基上接种菌浓度为10-2g/L和10-4g/L时的菌落形成单位（CFU）临床分离株，质控菌株H37Rv（MIC在0.1～0.2μg/ml）作为对照菌株。

HPLC方法有效性评价：HPLC测定Cm浓度方法的准确性和精确性见表1，对Cm低、中、高3个浓度监测发现Cm日内和日间的相对标准差（RSD）分别＜1.98%和＜2.78%。对于所有测试样本Cm回收率在98.99%～103.91%。Cm在不同介质中标准曲线在5～50μg/ml的浓度范围内表现出了良好的线性关系，r均＞0.998（表1）。HPLC检测Cm浓度时，Cm在罗氏培养基的最低检测限（LOD）为0.09μg/ml，最小定量限（LOQ）为0.25μg/ml。

结 果

1.Cm在罗氏培养基中的稳定性：在37℃保存时，Cm在罗氏培养基中10 d后就降解了46.8%，于30 d后无法检测到罗氏培养基中的Cm存在。

表1 3种Cm浓度HPLC检测的准确性和精确性

含Cm的罗氏培养基在4℃保存时，保存10 d时，罗氏培养基中的Cm降解2.04%，保存40 d时，Cm降解21.5%，保存80 d时，Cm降解41.7%，保存到200 d时，检测不到Cm的存在（图1）。

图1 含Cm的罗氏培养基在37℃、4℃保存条件下Cm的降解情况

2.比例法药敏试验结果：对部分MIC值接近或小于耐药临界值的结核分枝杆菌临床分离株和对照菌株H37Rv进行比例法DST检测。在新鲜制备的和在4℃存储时间分别为10～160 d的含Cm罗氏培养基中，对同一菌株进行比例法DST检测。当Cm对临床菌株的MIC＜0.05μg/ml时，不同存储时间的罗氏培养基上进行的DST检测结果差异没有统计学意义。当临床菌株的 MIC在临界值附近时，不同存储时间的DST检测结果差异有统计学意义；在存储时间超过40 d的罗氏培养基中，原本敏感的菌株可能会出现一个耐药的结果，并且含Cm罗氏培养基存储时间越长，菌落出现的越早；在4℃存储时间为160 d的含Cm罗氏培养基中，菌落出现要早于其他存储时间的含Cm罗氏培养基。部分结核分枝杆菌临床分离株和对照菌株H37Rv的比例法药敏试验结果见表2。

讨 论

随着耐药结核病在世界范围内的流行越来越广泛，以罗氏培养基为基础的DST检测技术在临床上的应用也越来越多。罗氏培养基为基础的DST检测技术在结核病高负担和低收入国家广泛应用。但是罗氏培养基为基础的DST检测技术存在一些缺

点，众所周知的就是使用固体培养基进行DST非常耗时，需要6周（比例法）时间报告结果，且结果有时不一致且重复性较低。另一个缺点是，该技术还没有完全标准化。虽然世界卫生组织制定了以罗氏培养基为基础的DST检测技术的标准操作程序，但有些指标很难标准化，例如，罗氏培养基的质量等。诸多不确定因素使得建立关于固体培养基DST的外部质量保证体系存在困难，由此也影响了实验室间同类检测数据的可比性。

表2 不同样本、MIC浓度与存储时间的结核分枝杆菌的比例法DST检测结果

关于HPLC测定RFP浓度的方法已被报道［6-8］，但并没有关于检测罗氏培养基Cm浓度的方法报道。本研究建立了一种快速、准确、可重复的以高效液相色谱法测定罗氏培养基中Cm浓度的方法，可以作为一种对含Cm培养基进行质量控制的方法。

含Cm培养基在4℃保存时相对于在37℃时保存要稳定，但是随着存储时间的延长，Cm的降解也很明显（图1）。从理论上讲，随着存储时间的延长，培养基中的Cm浓度降低，则使用不同存储时间的培养基进行DST必然会产生一些不一致的检测结果，势必有部分敏感株在存储时间较长的培养基中DST检测结果为耐药。根据对含Cm的罗氏培养基在存储过程中药物稳定性的检测数据，不推荐使用存储超过40 d的含Cm罗氏培养基进行DST检测；本研究中多项数据表明，培养基中药物的降解可能是导致实验室DST检测结果“假阳性”的一个原因。

［1］Bloom BR，Murray CJ.Tuberculosis：commentary on a reemergent killer.Science，1992，257（5073）：1055-1064.

［2］闫丽萍，唐神结，秦莲花，等.对利福平敏感的多耐药结核分枝杆菌rpoB基因突变一例.中国防痨杂志，2013，35（2）：146-148.

［3］Sharma SK，Mohan A.Multidrug-resistant tuberculosis：a menace that threatens to destabilize tuberculosis control. Chest，2006，130（1）：261-272.

［4］孙蕾，王毳，赵卓，等.衔接分子胱天蛋白酶募集域蛋白9与抗结核免疫的相关性.中国防痨杂志，2013，35（3）：204-206.

［5］Mukherjee JS，Rich ML，Socci AR，et al.Programmes and principles in treatment of multidrug-resistant tuberculosis. Lancet，2004，363（9407）：474-481.

［6］Leonard B，Coronel J，Siedner M，et al.Inter-and intra-assay reproducibility of microplate Alamar blue assay results for isoniazid，rifampicin，ethambutol，streptomycin，ciprofloxacin，and capreomycin drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis.J Clin Microbiol，2008，46（10）：3526-3529.

［7］El-Sayed Zaki M，Goda T.Rapid phenotypic assay of antimycobacterial susceptibility pattern by direct mycobacteria growth indicator tube and phage amplified biological assay compared to BACTEC 460 TB.Tuberculosis（Edinb），2007，87 （2）：102-108.

［8］Yu X，Jiang G，Li H，et al.Rifampin stability in 7H9 broth and Löwenstein-Jensen medium.J Clin Microbiol，2011，49 （3）：784-789.

The research on capreomycin stability in Roche medium

JIANG Yong*，QIAN Ming，WANG Wei，CHEN Tao，LI Hai-cheng，CHEN Yan-mei，ZHUO Wen-ji，GUO Hui-xin，ZHOU Lin，ZHONG Qiu.*Center for Tuberculosis Control and Prevention of Guangdong Province，Guangzhou 510630，China

ZHOU Lin，Email：gdtb-bg@vip.163.com；ZHONG Qiu，Email：zhongqiu@vip.163.com

Objective To detect the stability of capreomycin（Cm）in the Roche medium，and find out the degradation rate of Cm in Roche medium and to detect the influence of Cm degradation on drug sensitive test. Methods The high performance liquid chromatograph（HPLC）test was used to detect the stability of Cm under preservation condition of 4℃and 37℃in Roche medium；Cm under different preservation condition was used to conduct drug sensitive test（DST）to detect the influence of Cm degradation on drug sensitive test.Results Preserved in 4℃，the concentration of Cm in Roche medium is inversely proportional to time，the degradation of Cm in Roche medium is close to 2.04%after 10 days，the degradation is 21.5%after 40 days，the degradation is 41.7% after 80 days，and Cm was not detected after 200 days.Preserved in 37℃，the degradation of Cm in Roche medium is close to 46.8%after 10 days，and Cm was not detected after 30 days.In the Cm Roche medium preserved at 4℃for 10-160 days，DST results showed that in the strain which minimal inhibitory concentration（MIC）is between 0.1 to 0.2μg/ml，16 colonies were observed after 6 weeks in the Roche medium preserved in 4℃for 40 days.In the strain which MICis between 1.0 to 1.5μg/ml，positive result（十）was reported after 6 weeks in the Roche medium preserved in 4℃for 40 days.Conclusion Cm Roche medium is unstable when stored at 37℃，it should be preserved at 4℃and should be used within 40 days.

Mycobacterium tuberculosis； Culture media； Microbial sensitivity tests； Capreomycin sulfate；Chromatography，high pressure liquid

2013-06-06）

（本文编辑：薛爱华）

“十二五”国家科技重大专项（2013ZX10003001）

510630广州，广东省结核病控制中心（江勇、钱明、陈涛、李海成、陈燕梅、卓文基、郭卉欣、周琳、钟球）；广东省佛山市第四人民医院检验科（王威）

周琳，Email：gdtb-bg@vip.163.com；钟球，Email：zhongqiu@vip.163.com