李 帅，胡继荣，刘军军，何 杰，马兴元，吴冬青

（河西学院化学化工学院 甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，甘肃 张掖734000）

黑柴胡（Bupleurum smithii Wolff），别称小五台柴胡、小五吕柴胡、杨家坪柴胡，是伞形科柴胡属多年生草本植物，主要分布于河北、山西、陕西、河南、青海、甘肃等地，味苦、性微寒，具有解热、抗炎等功效［1］。大孔吸附树脂具有吸附快、容量大、洗脱率高、可再生等优点［2］，广泛应用于分离黄酮、多糖、生物碱等化合物［3－5］。作者利用X－5大孔吸附树脂对黑柴胡黄酮粗提液进行分离纯化，并对纯化前后黑柴胡黄酮清除·DPPH、ABTS＋能力及还原力进行比较，旨在为分离纯化黑柴胡黄酮提供参考。

1 实验

1．1 材料、试剂与仪器

黑柴胡，2010年采自甘肃陇西。

X－5大孔吸附树脂，南开大学化工厂；芦丁，生化试剂，医药集团上海化学试剂公司；·DPPH，梯希爱化成工业发展有限公司；ABTS，东京化成工业株式会社；抗坏血酸（Vc）、丁基羟基茴香醚（BHA）、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、丙酮、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁等均为分析纯。

WFJ2100型可见分光光度计，尤尼柯仪器有限公司；RE－2000A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHA－B型恒温振荡器，国华电器有限公司。

1．2 方法

1．2．1 黑柴胡黄酮提取流程

干燥黑柴胡→粉碎→过50目筛→75%乙醇回流1h［料液比1∶30（g∶mL）］→提取2次→滤液合并→浓缩至无醇味→定容至100mL→黑柴胡黄酮粗提液冷藏备用。

1．2．2 黑柴胡黄酮的分离纯化

1．2．2．1 树脂的预处理［6］

X－5大孔吸附树脂10g→丙酮回流3h（水浴温度50℃）→过滤→95%乙醇浸泡24h→过滤→蒸馏水洗至无醇味→过滤→5%HCl浸泡3h→过滤→蒸馏水洗至中性→5%NaOH浸泡3h→过滤→蒸馏水洗至中性→抽干→冷藏备用。

1．2．2．2 静态吸附实验［6，7］

准确称取已处理好的树脂1．000g置于100mL具塞锥形瓶中，加入pH值为2的0．09410mg·mL－1黄酮粗提液25．00mL，振荡（30 ℃，转速150r·min－1）吸附12h，准确吸取上清液1．00mL测定黄酮质量浓度，按式（1）计算吸附率：

式中：c为吸附前溶液的黄酮质量浓度；c′为吸附后溶液的黄酮质量浓度。

按上述方法，首先考察黄酮粗提液pH值对吸附效果的影响，选择适宜的pH值；然后在吸附中每隔1h吸取上清液测定黄酮质量浓度，绘制静态吸附动力学曲线；最后改变粗提液中黄酮的质量浓度进行实验，绘制吸附等温曲线。

1．2．2．3 解吸实验［6，7］

将最佳静态吸附条件下吸附饱和树脂过滤，用蒸馏水冲洗后置于100mL具塞锥形瓶中，加入不同体积分数的乙醇50．00mL，振荡（60℃，转速150r·min－1）解吸12h，准确吸取解吸液1．00mL测定黄酮质量浓度，按式（2）计算解吸率并绘制静态解吸曲线，选择最佳解吸剂。

式中：c为吸附前溶液的黄酮质量浓度；c′为吸附后溶液的黄酮质量浓度；V为吸附液的体积；c″为解吸液的黄酮质量浓度；V′为解吸液的体积。

1．2．2．4 动态吸附－解吸实验［6－8］

将已处理好的X－5大孔吸附树脂湿法装柱，径高比为1cm∶10cm。在静态吸附实验、解吸实验基础上，将一定质量浓度、一定pH值黄酮粗提液以1mL·min－1的流速上柱，充分吸附饱和后，用4BV去离子水冲洗，然后依次用静态解吸优选出的最佳解吸剂进行洗脱（洗脱流速1mg·min－1）。收集解吸液，测定吸光度，计算黄酮质量浓度。

1．2．3 黑柴胡黄酮质量浓度的测定

参照文献［9］，采用 NaNO2－Al（NO3）3－NaOH 法，以芦丁为基准物质测定黑柴胡黄酮的质量浓度。拟合标准曲线的回归方程为A＝11．079c－0．029［A为吸光度 值、c 为黄酮质量 浓 度 （mg·mL－1）］，R2＝0．99987，线性范围为0．0094～0．0564mg·mL－1。

移取0．1mL黑柴胡黄酮液于25mL容量瓶中，按照标准曲线测定方法测定吸光度，根据回归方程计算黑柴胡黄酮质量浓度。

1．2．4 黑柴胡黄酮抗氧化性研究

1．2．4．1 黑柴胡黄酮对·DPPH的清除作用

参照文献［10］，方法略有改动：分别移取纯化前后不同质量浓度黄酮液1．00mL于试管中，加入100μg·mL－1的·DPPH溶液1．00mL，补水至5mL，避光放置30min后在517nm下测定吸光度Ai，以相同质量浓度的Vc、BHA作阳性对照。按式（3）计算清除率：

式中：A0为未加黄酮液的·DPPH溶液的吸光度；Aj为相应质量浓度黄酮液的本底吸光度。

1．2．4．2 黑柴胡黄酮对ABTS＋的清除作用

参照文献［11］方法，配制ABTS＋工作液。分别移取纯化前后不同质量浓度黄酮液1．00mL于试管中，加入2．00mL ABTS＋工作液，补水至5mL，室温放置20 min后，于734nm处测定吸光度A′i。以相同质量浓度的Vc、BHA作阳性对照。按式（4）计算清除率：

1．2．4．3 黑柴胡黄酮还原力的测定

参照文献［12］方法进行测定，以Vc、BHA作阳性对照，测定700nm处吸光度。

2 结果与讨论

2．1 黑柴胡黄酮粗提液的质量浓度

根据1．2．1方法做平行实验3次，黑柴胡黄酮粗提液的平均质量浓度为10．75mg·mL－1，RSD为0．16%。

2．2 黄酮粗提液pH值对吸附率的影响（图1）

图1 pH值对吸附率的影响Fig．1 The effect of pH value on adsorption rate

由图1可知，pH值在1～2之间的吸附率较高，随着pH值的增大，吸附率降低。这是因为，黄酮为多羟基酚类，呈现一定的弱酸性，在酸性条件下以分子状态存在，主要以范德华力被树脂物理吸附，而在碱性条件下，黄酮可形成佯盐，以离子形式存在，不易被树脂吸附［13］，吸附率降低。因此，选择适宜的黄酮粗提液pH值为2。

2．3 静态吸附动力学曲线（图2）

由图2可知，X－5大孔吸附树脂可在短时间内达到较大吸附量，吸附3h时的树脂吸附率达到85．85%；吸附7h时，吸附趋于饱和。因此，选择适宜的静态吸附时间为7h。

2．4 静态吸附等温曲线（图3）

由图3可知，粗提液中黄酮质量浓度对吸附率的影响较大。当黄酮质量浓度为0．369mg·mL－1时，吸附率达到最大值93．58%；继续增大黄酮质量浓度，吸附率有所减小。这是因为，黄酮浓度较大时，因其结构中含有酚羟基、羰基官能团［14］，易于形成氢键而成为聚合大分子，不易被吸附。因此，选择黄酮粗提液最佳上样浓度为0．369mg·mL－1。

2．5 解吸剂筛选

考察乙醇体积分数对解吸率的影响，结果见图4。

图4 乙醇体积分数对解吸率的影响Fig．4 The effect of ethanol volume fraction on desorption rate

由于黄酮类化合物大多为极性且其极性范围较广［14］，根据“相似相容”原理，不同极性的黄酮化合物应溶于不同体积分数的乙醇中。由图4可知，不同体积分数的乙醇对饱和树脂的解吸能力不同，45%乙醇解吸效果最好（解吸率92．54%），65%乙醇次之（解吸率87．73%）。因此，选择45%、65%乙醇作为动态解吸剂。

2．6 动态洗脱曲线（图5）

图5 动态洗脱曲线Fig．5 Dynamic curves of ethanol desorption

由图5可知，45%乙醇洗脱完全需70mL，65%乙醇洗脱完全需75mL。45%乙醇洗脱液和65%乙醇洗脱液中黄酮质量浓度分别为1．323mg·mL－1和0．1183mg·mL－1。

2．7 纯化前后黑柴胡黄酮抗氧化能力

2．7．1 黑柴胡黄酮对·DPPH的清除作用

·DPPH是一种较稳定的自由基，当加入样品后，若含有抗氧化物质提供电子与·DPPH配对使其颜色变浅，通过褪色程度就可以衡量清除活性的大小［15］。测定不同质量浓度黑柴胡黄酮液及对照的·DPPH清除能力及IC50值，结果见图6和表1。

图6 清除·DPPH能力Fig．6 The ability of scavenging·DPPH

由图6可知，在实验范围内，随着各样品质量浓度的增大，·DPPH清除率均呈递增趋势，但45%乙醇洗脱液、65%乙醇洗脱液和粗提液与对照相比，增加缓慢。

由表1可知，由IC50值确定的清除·DPPH能力大小依次为：BHA＞Vc＞45%乙醇洗脱液＞65%乙醇洗脱液＞粗提液，45%乙醇洗脱液和65%乙醇洗脱液较粗提液半数清除率分别提高了44．56%、24．70%，说明45%乙醇洗脱液含有清除·DPPH成分多于65%乙醇洗脱液。

表1清除·DPPH的IC50值Tab．1 The IC50values for scavenging·DPPH

2．7．2 黑柴胡黄酮对ABTS＋的清除作用

ABTS＋是一种经氧化后形成的绿色自由基，当加入样品后，若含有抗氧化物质提供供氢体使其颜色变浅，其褪色程度与抗氧化剂浓度呈正相关［15］。测定不同黑柴胡黄酮液及对照的清除ABTS＋能力和IC50值，结果见图7和表2。

由图7可知，各样品清除ABTS＋能力与质量浓度均呈正相关，而且纯化后黄酮液清除ABTS＋能力强于对照。

图7 清除ABTS＋能力Fig．7 The ability of scavenging ABTS＋

由表2可知，由IC50值确定的清除ABTS＋能力大小为：65%乙醇洗脱液＞45%乙醇洗脱液＞Vc＞粗提液＞BHA，45%乙醇洗脱液和65%乙醇洗脱液较粗提液半数清除率分别提高了33．91%、51．66%，说明65%乙醇洗脱液含有清除ABTS＋成分多于45%乙醇洗脱液。此外，45%乙醇洗脱液、65%乙醇洗脱液和粗提液的清除ABTS＋能力均显著强于其清除·DPPH能力。

表2清除ABTS＋的IC50值Tab．2 The IC50values for scavenging ABTS＋

2．7．3 黑柴胡黄酮的还原力（图8）

在还原力测定中，吸光度越大表明抗氧化性越强，还原力越强［16］。由图8可知，在实验测定范围内，各样品还原力与质量浓度均呈正相关。还原力大小依次为：Vc＞45%乙醇洗脱液＞BHA＞65%乙醇洗脱液＞粗提液，45%乙醇洗脱液和65%乙醇洗脱液较粗提液还原力分别提高了47．80%、23．59%，说明X－5大孔吸附树脂是分离纯化黑柴胡黄酮的优良树脂。

图8 还原力Fig．8 The reducing ability

3 结论

（1）X－5大孔吸附树脂对黑柴胡黄酮有较好的吸附和解吸效果。其最佳静态吸附条件为：粗提液中黄酮上样浓度为0．369mg·mL－1、pH 值1～2、吸附时间为7h，最大吸附率达到93．58%；45%乙醇、65%乙醇静态解吸效果相对较好，解吸率分别为92．54%、87．73%；45%乙醇、65%乙醇动态洗脱液中黄酮质量浓度分别为1．323mg·mL－1、0．1183mg·mL－1。

（2）考察了纯化前后黑柴胡黄酮的抗氧化性。由IC50值可知，清除·DPPH的能力大小依次为：45%乙醇洗脱液＞65%乙醇洗脱液＞粗提液，清除ABTS＋的能力大小依次为：65%乙醇洗脱液＞45%乙醇洗脱液＞粗提液，还原力大小依次为：45%乙醇洗脱液＞65%乙醇洗脱液＞粗提液；45%乙醇洗脱液、65%乙醇洗脱液和粗提液的清除·DPPH能力均显著弱于其清除ABTS＋能力；45%乙醇洗脱液、65%乙醇洗脱液抗氧化能力均强于粗提液，说明X－5大孔吸附树脂是分离纯化黑柴胡黄酮的优良树脂。

［1］雷岚芬，孟祥龙．黑柴胡与柴胡的生药学比较研究［J］．山西中医学院学报，2011，12（5）：21－22．

［2］李淑珍，李进，杨志江，等．大孔树脂分离纯化黑果枸杞总黄酮的研究［J］．食品科学，2009，30（1）：19－24．

［3］李晨，姜子涛，李荣．大孔吸附树脂纯化樱桃叶中总黄酮的研究［J］．食品科技，2012，37（9）：212－217．

［4］仰榴青，徐佐旗，茆广华，等．大孔吸附树脂纯化银杏外种皮多糖的研究［J］．中药材，2006，29（10）：1098－1100．

［5］陆世惠，龙盛京．D－101大孔树脂分离纯化两面针总生物碱［J］．西北药学杂志，2013，28（1）：7－9．

［6］张勇，李彩霞，麻贝贝，等．大孔吸附树脂纯化“黑美人”土豆色素研究［J］．食品工业科技，2012，33（2）：345－348．

［7］洪雪娥，高荫榆，罗丽萍，等．大孔树脂对薯蔓黄酮吸附分离特性研究［J］．食品科学，2006，27（10）：423－427．

［8］汪茜，何宇新，邓芸．大孔吸附树脂纯化贯叶连翘总黄酮工艺研究［J］．成都医学院学报，2008，3（4）：256－258．

［9］齐柳娅，郁建平，田晶，等．大孔吸附树脂分离纯化追风伞总黄酮的研究［J］．化学与生物工程，2010，27（1）：37－40．

［10］袁王俊，李彩芳，丁秋瑾，等．黄连抗氧化活性研究［J］．广西植物，2009，29（5）：694－697．

［11］廖月霞，王笑娜，孔桂美，等．半枝莲乙醇提取物体外抗氧化活性研究［J］．时珍国医国药，2012，23（3）：520－522．

［12］王芙蓉，吴冬青，安红钢，等．当归总黄酮提取工艺及体外抗氧化性研究［J］．中兽医医药杂志，2010，29（5）：11－15．

［13］张斌，孙兰萍，马龙，等．大孔吸附树脂分离纯化花生壳总黄酮的研究［J］．中国粮油学报，2010，25（2）：126－130．

［14］郭雪峰，岳永德．黄酮类化合物的提取·分离纯化和含量测定方法的研究进展［J］．安徽农业科学，2007，35（26）：8083－8086．

［15］赵晓莉，陈卫军，赵松林，等．椰子种皮油提取物的抗氧化活性研究［J］．热带作物学报，2012，33（1）：162－165．

［16］马利华，贺菊萍，秦卫东，等．槐花提取物抗氧化性能研究［J］．食品科学，2007，28（9）：75－77．