王田田，周星，柏玉香，王金鹏，谢正军，金征宇

(江南大学，食品组分与物性中心，江苏 无锡，214122)

环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase，EC 2.4.1.19)是一种多功能性酶，属于α-淀粉酶家族。CGTase 可以同时催化4 种不同的反应，包括水解反应，环化反应，耦合反应，歧化反应［1，4］。利用CGTase 环化反应生产环糊精(CDs)是CGTase 的一种重要应用，随着环糊精在食品、医药等领域的应用越来越广，生产环糊精所必需的CGTase 越来越成为当今学者研究的热点［2-4］。然而利用CGTase 环化作用生产环糊精，得到的往往是α-CD，β-CD 及γ-CD3 种环糊精的混合产物，在工业生产中，产品的后续分离纯化操作复杂而耗时。因此，对CGTase 的产物专一性研究一直以来都是研究者们探究的热门课题［4-13］。荷兰格罗宁根大学的Dijkhuizen 团队以底物麦芽低聚糖中的葡萄糖基为参照，标记出了+2 ～-7 这9 个该酶与底物的结合亚位点［4，20-22］(图1)，确定了该CGTase 环化作用的主要产物与底物结合亚位点密切相关，只有当环化作用前伴随耦合反应时，才能产生其他种类的环状糊精。而根据CGTase 的酶与底物的结合模型分析，在CGTase 活性中心的底物结合位点附近存在一定的空间，反应过程中的生成受体糖苷储存在其中，导致耦合作用或歧化作用的发生，从而改变产物中3种环糊精的比例，影响产物专一性［15-16］。

综上可知，酶自身的结构的不同，以及反应过程中耦合歧化作用的发生，是影响CGTase 产物专一性的2 个重要因素。目前国内对于CGTase 产物专一性的研究大多集中于前者，通过抑制酶的耦合歧化作用来提高CGTase 产物专一性的研究目前还很少研究［17］。我们希望通过超高压作用压缩CGTase 底物结合位点附近空间大小，抑制耦合歧化作用的发生，最终提高CGTase 产物专一性。

图1 来源于B. circulans 251 的CGT 酶与麦芽九糖抑制剂在活性位点上相互作用示意图［4，19］Fig.1 Schematic representation of the interactions between B. circulans strain 251 CGTase and a maltononaose at the active site［4，19］

食品超高压处理是指使用100 MPa 以上(100 ～1 000 MPa)的压力，在常温下或较低温度下对食品物料进行处理，从而达到灭菌、物料改性和改变食品某些理化反应速度的效果［18］。超高压能够影响非共价键的形成与破坏，但不破坏共价键，非共价键是维持酶分子高级结构的主要原因，因而超高压能够影响酶分子的高级结构［19］。

目前，还没有人研究超高压对CGTase 酶学性质及其产物专一性的影响。本研究旨在通过调整高压腔内介质的温度，压力，改变高压后酶反应的时间，探究高压过程对于α-CGTase 产物专一性的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料

软化芽孢杆菌α-CGTase，日本天野酶制品株式会社;α-CD、β-CD 及 γ-CD 标 准 样 品，SIGMAALDRICH 公司;可溶性淀粉，国药集团化学试剂有限公司;乙腈、超纯水均为色谱级;其他试剂均为分析纯。

1.2 实验设备

双光束紫外可见分光光度计(TU-1900)，北京普析通用仪器有限责任公司;电热恒温水浴锅，上海浦东物理光学仪器厂;高效液相色谱仪(LC-20AT 230V)，岛津公司;示差折光检测器(RID-10A)，岛津公司;Hypersil NH2色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm APS-2 Hypersil 微粒)，美国Thermo 公司;S-FL-085-09-W 超高压仪器，英国Stansted Fluid Power 公司。

2 实验方法

2.1 试样的准备

取一定量pH 6.0 磷酸缓冲液稀释的酶于2mL的甘油管中，保障甘油管中盛满酶液且残余气泡体积尽量少(防止高压过程中气泡的存在使得甘油管爆裂)。将甘油管4℃冰浴保存，等待高压处理或作为对照样等待检测酶活性。

为了避免实验数据受实验操作和酶的放置时间的影响，同批次试样均一次制作完成，放置在4℃的冰浴里，并在12 h 内高压处理完毕，处理后试样保存在4℃的冰箱里，在48 h 内完成过α-CGTase 活性检测。所有数据均为3 个试样测试后的平均值［23］。

2.2 超高压处理

高压处理:先将与超高压仪器相连的水浴锅设定到实验指定温度，待温度稳定20 min 后，将试样浸没于高压容器的传压介质中，按照实验设计，设定压力、保压时间等参数，进行超高压处理。

2.3 α-环化活力的测定

将适当稀释经高压处理过的α-CGTase 的酶液加入装有预先用50 mmol/L 磷酸缓冲液(pH 6.0)配制2 g/100 mL 可溶性淀粉溶液的试管中，充分混匀，在60 ℃反应10 min 后，沸水浴10 min 终止反应。以未经高压处理过的α-CGTase 做对照组进行反应。使用HPLC 测定产物中α-CD 含量。酶活力单位(U)定义为:在上述条件下每分钟生成1μmol α-环糊精所需的酶量［24-25］。

2.4 HPLC 法测定环糊精产量

采用HPLC 法进行酶产物分析。用磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)配制2 g/100 mL 淀粉溶液，沸水浴中加热糊化10 min，冷却至反应温度后添加一定量的α-CGTase，充分混匀后在60 ℃、200 r/min 水浴摇床中反应一定时间，沸水浴10 min 灭酶后于12 000 r/min 离心20 min，上清液经0.45 μm 超滤膜过滤后取20μL 上机分析。采用HPLC 进行产物分析的色谱条件为:流动相为65%乙腈水溶液，流速1 mL/min;柱温40℃。

3 结果与分析

3.1 环糊精产量的HPLC 法测定

利用HPLC 对反应产物中α-CD，β-CD，γ-CD 进行检测，如图2 所示，α-CD，β-CD，γ-CD 3 种环糊精的出峰位置分别为7.557，8.709，10.369。

反应得率:

产物专一性:

其中，B1，B2，B3分别表示α-CD，β-CD，γ-CD 的含量，mg/mL;M 表示参与反应的总淀粉的含量，mg/mL。

3.2 压力对α-CGTase 环化反应的影响

为了探究α-CGTase 在不同高压下的变化特性，在40 ℃、保压10 min、酶液pH 值为6.0 的条件下，进行5 种压力(100、200、300、400 和500 MPa)的高压处理，对照组为常压(0.1 MPa)40 ℃水浴10 min 后的酶。α-CGTase 催化淀粉反应10 h，利用HPLC 测得环糊精含量，从而得到压力对α-CGTase 产物专一性的影响，实验结果如表1 所示。

图2 α-CGTase 催化淀粉反应产物中的α-，β-，γ-CD 的液相图Fig.2 HPLC chromatogram of α-，β-，γ-CD from starch catalyzed by α-CGTase

表1 不同压力对于α-CGTase 的影响Table 1 Effect of different pressures on α-CGTase

由表1 可见，在40 ℃下，用不高于200 MPa 的压力处理CGTase，α-CGTase 的环化活力有一定的升高，当压力≥300 MPa，随着压力增大酶迅速失活;而随着压力的增大，α-CGTase 的产物专一性均有明显的提高;产物得率则随压力的升高而逐渐降低。推测造成以上现象的原因可能是:在40 ℃和200 MPa 左右的较低压力下，高压作用主要对酶起到压缩效应，改变酶蛋白的非共价结构，没有破坏酶蛋白骨架结构［18-19］，对酶的环化活力有一定的增强作用，随着压力的逐渐增大，酶蛋白结构遭到破坏，酶逐渐失活;而高压过程导致α-CGTase 底物结合位点附近空间被压缩，反应过程中的耦合作用和歧化作用受到抑制，酶环化反应产物专一性得到增强。

3.3 温度对α-CGTase 环化反应的影响

为了考察α-CGTase 超高压处理时温度对酶环化反应的影响，实验设定压力为200 MPa、酶液pH 值6.0(酶的最适PH)，保压10 min 的条件下，进行5 种保压温度(25、40、50、60 和70 ℃)的高压处理，对照组为常压(0.1 MPa)相应温度水浴10 min 的α-CGTase。α-CGTase 催化淀粉反应10 h，利用HPLC 测得环糊精含量，从而得到温度对α-CGTase 产物专一性的影响。实验结果如表2 所示。

表2 不同温度下高压对于α-CGTase 的影响Table 2 Effect of pressures on α-CGTase at different tempreture

由表2 可以看出，在200 MPa 下，不同温度处理α-CGTase 后，其环化活力随温度升高而降低，25℃时环化活力最大;而产物专一性随着温度的升高先增大后减小，在40℃时最大为55.9%;产物得率随着温度的升高在不断减小。由此可以推断，在200 MPa 低温(≦40℃)处理酶后，高压对于α-CGTase 底物结合位点附近空间有压缩效应，可以一定程度地抑制反应过程中的耦合作用和歧化作用，从而提高产物专一性;200 MPa 和较高温度(＞40℃)作用后，由于温度与高压的协同作用，酶的结构发生破坏，环化反应减弱且产物专一性变差。而由于高压与温度的协同作用，破坏酶底物结合中心蛋白质的高级结构［18-19］，使得α-CGTase 与淀粉的结合能力变弱，α-CGTase 得率随着温度的升高而下降。

3.4 高压后反应时间对α-CGTase 产物专一性的影响

由于α-CGTase 催化淀粉反应过程中，随着反应时间的不同，各种催化作用的强弱也各不相同，最终导致3 种环糊精比例随反应时间不同而不同［15-16］。为了进一步探究超高压对于α-CGTase 产物专一性影响，通过将超高压处理后的α-CGTase 设置不同的反应时间，来探究不同压力作用于α-CGTase 后该酶产物专一性的变化。实验设定保压温度为40℃、酶液pH 值为6.0(酶的最适pH)，保压时间为10 min 的条件下，进行5 种压力(100、200、300、400 和500 MPa)的高压处理，对照组为常压(0.1 MPa)40℃水浴10 minα-CGTase。高压处理α-CGTase 后，酶与淀粉的反应时间分别为10 min，1 h，10 h。超高压处理酶后不同反应时间对α-CGTase 产物专一性的影响如图3 所示，产物得率的变化规律如图4 所示。

图3 高压后的α-CGTase 在不同反应时间下产物专一性的变化Fig.3 The changes of product specificities of α-CGTase treated by various pressures at different reaction times

图4 不同高压处理后的α-CGTase 在不同反应时间下产物得率的变化Fig.4 The changes of production yields of α-CGTase treated by various pressures at different reaction times

由图3 可知，随着反应时间的延长，α-CGTase 产物专一性不断降低;在相同反应时间下，产物专一性随着处理α-CGTase 的压力增大而提高。由图4 可知，随着处理α-CGTase 压力的增大，α-CGTase 催化淀粉反应产物得率不断降低;而随着α-CGTase 催化淀粉反应时间的延长，α-CGTase 催化淀粉反应产物得率不断提高。这是由于α-CGTase 催化淀粉反应是一个动态的多催化作用反应过程，α-CGTase 同时发挥这4 种催化作用，尤其是在反应的后期，反应体系中有多种底物存在，耦合歧化作用增强，因此反应时间越长，产物的专一性越低，同时产物的得率越高。

4 结论

超高压处理α-CGTase，随着压力的增大，α-CGTase 的环化活力先有一定的升高，然后快速降低，且不论反应时间的长短，在同一反应时间下，产物专一性均随压力增大而不断提高，在500 MPa 时催化淀粉反应10 h，产物专一性将达到71.75%，但产物的得率均随着压力提高而减小。在200 MPa 下，不同温度处理α-CGTase 后，其环化活力随温度升高而降低，25℃时环化活力最大，为62.49 U/ mL;而产物专一性随着温度的升高先增大后减小，在40℃时最大为55.9%;产物得率随着温度的升高在不断减小。此外，在相同高压条件下，产物专一性随反应时间延长而降低，产物得率随反应时间延长而增大。本文主要讨论了不同压力，温度下高压处理α-CGTase 后环化反应产物专一性的变化，以及高压过后不同的反应时间下酶产物专一性的变化，对于高压处理后酶结构的变化还需进一步研究。

［1］ Van der Veen B，van Alebeek G，Uitdehaag J，et al. The three transglycosylation reactions catalyzed by cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans (strain 251)proceed via different kinetic mechanisms［J］. European Journal of Biochemistry，2000，267(3):658 -665.

［2］ Li Z F，Wang M，Wang F，et al.γ-Cyclodextrin:a review on enzymatic production and applications［J］.Applied Microbiology Biotechnology，2007，77(2):245 -255.

［3］ van de Manakker F，Vermonden T，van Nostrum C F，et al. Cyclodextrin-based polymeric materials:synthesis，properties，and pharmaceutical/biomedical applications［J］. Biomacromolecules，2009，10(12):3157 -3175

［4］ 李兆丰，顾正彪，堵国成，等. 环糊精葡萄糖基转移酶的结构特征与催化机理［J］. 中国生物工程杂志，2010，30(6):144 -150

［5］ Tonkova A. Bacterial cyclodextrin glucanotransferase［J］.Enzyme and Microbial Technology，1998，22(8):678-686.

［6］ Li Z F，Zhang J Y，Sun Q，et al. Mutations of lysine 47 in cyclodextrin glycosyltransferase from Paenibacillus macerans enhance β-cyclodextrin specificity［J］. Journal Agricultural and Food Chemistry，2009，57(18):8 386-8 391.

［7］ Li Z F，Zhang J Y，Wang M，et al. Mutations at subsite-3 in cyclodextrin glycosyltransferase from Paenibacillus macerans enhancing α-cyclodextrin specificity［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2009，83(3):483-490.

［8］ Kelly R M，Dijkhuizen L，Leemhuis H. The evolution of cyclodextrin glucanotransferase product specificity［J］. Applied Microbiology Biotechnology，2009，84(1):119 -133.

［9］ 丁闰蓉，李兆丰，李金根，等. 表面活性剂对大肠杆菌胞外生产α-环糊精葡萄糖基转移酶的影响［J］. 中国生物工程杂志，2009，29(7):61 -66.

［10］ 李兆丰. 软化类芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达及其产物特异性分析［D］. 无锡:江南大学，2009.

［11］ Leemhuis H，Kelly RM，Dijkhuizen L. Engineering of cyclodextrin glucanotransferases and the impact for biotechnological applications［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2010，85(4):823 -835.

［12］ 曹新志，金征宇. 环糊精包合物的制备方法［J］. 食品工业科技，2003，24(10):158 -160.

［13］ 曹新志，金征宇. 环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株的快速筛选［J］. 中国粮油学报，2003，18(6):53 -55.

［14］ Penninga D，van der Veen B，Knegtel R，et al. The raw starch binding domain of cyclodextrin glycosyltransferase fom Bacillus circulans strain 251［J］. Journal of Biological Chemistry，1996，271(51):32 777 -32 784.

［15］ Uitdehaag J，Kalk K，van der Veen B，et al. The cyclization mechanism of cyclodextrin glycosyltransferase as revealed by a γ-cyclodextrin-CGTase complex at 1.8Å resolution［J］. Journal of Biological Chemistry，1999，274(49):34 868 -34 876.

［16］ Schmidt A，Cottaz S，Driguez H，et al. Structure of cyclodextrin glycosyltransferase complexed with a derivative of its main product β-cyclodextrin［J］. Biochemistry，1998，37(17):5 909 -5 915

［17］ Ramli N，Abd-Aziz S，Hassan M，et al. Potential cyclodextrin glycosyltransferase producer from locally isolated bacteria［J］. African Journal of Biotechnology，2010，9(43):7 317 -7 321.

［18］ 陈复生. 食品超高压加工技术［M］. 北京:化学工业出版社，2005.

［19］ Zhengyu Jin，Xiuting Hu，Xueming Xu，et al. Retrogradation properties of rice starch gelatinized by heat and high hydrostatic pressure (HHP)［J］. Journal of Food Engineering，2011，106(3):262 -266.

［20］ Strokopytov B，Knegtel R M，Penninga D，et al.Structure of cyclodextrin glycosyltransferase complexed with a maltononaose inhibitor at 2.6 angstrom resolution. Implications for product specificity［J］. Biochemistry，1996，35(13):4 241 -4 249.

［21］ Bender H. Studies of themechanism of the cyclisation reaction catalysed by the wild type and a truncated α-cyclodextrin glycosyltransferase from Klebsiella pneumoniae strain M5 al and the β-cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans strain 8［J］. Carbohydrate Research，1990，206(2):257 -267.

［22］ Wind R D，Uitdehaag J C M，Buitelaar R M，et al，Engineering of cyclodextrin product specificity and pH optima of the thermostable cyclodextrin glycosyltransferase from Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes EM1［J］.The Journal of Chemical Physics，1998，273(10):5 771-5 779.

［23］ 曾庆梅，潘见，谢慧明，等. 超高压处理对多酚氧化酶活性的影响［J］. 高压物理学报，2004，18(2).

［24］ Lejeune A，Sakaguchi K，Imanaka T.A spectrophotometric assay for the cyclization activity of cyclomaltohexaose(α-cyclodextrin)glucanotransferase［J］. Analytical Biochemistry，1989，181(1):6 -11.

［25］ 刘虹，顾正彪，洪雁，等.甲基橙褪色分光光度法定量测定α-环糊精［J］.中国粮油学报，2008，23(5):1 773 -1 776.