杨晓杰， 赵付安， 唐中杰， 李 武， 赵元明， 谢德意， 房卫平

(1.河南省农业科学院经济作物研究所，河南 郑州 450002;2.棉花生物学国家重点实验室，中国农业科学院棉花研究所，河南安阳455000)

棉花黄萎病是由真菌病原大丽轮枝菌(Verticilli-um dahliae)引起的维管束病害，曾给中国棉花生产造成了巨大的损失［1－4］。利用物理化学等手段防治黄萎病的效果均不特别理想［5］。而且，目前主栽品种陆地棉及海岛棉对黄萎病菌抗性不强及大丽轮枝菌自身致病机理复杂等原因，造成棉花黄萎病尚未得到有效控制［6］。作为最大的抗病基因类别，编码 TIR－NBSLRR类抗病蛋白质的R基因在保护植物免受病原菌侵害中起着十分重要的作用［7］。利用基因工程方法培育棉花抗黄萎病品种是控制棉花黄萎病的有效途径［8］。对此，国内外学者对抗病基因在抗黄萎病中的作用做出了许多有益的探索。例如，赵磊等利用同源序列克隆策略从高抗黄萎病棉花品种KV－1中扩增具有抗病基因典型结构的抗病基因同原序列［9］，这无疑为克隆抗病基因奠定了基础。并且在植物，特别是模式植物中NBS－LRR蛋白质与病原菌分泌的效应蛋白质的直接［10－11］或间接识别［12－13］、NBS－LRR 蛋白质的同源或异源［14－15］低聚体化及其亚细胞表达定位［16－17］等均取得了较大的进展。

目前，研究者已着手从抗病基因的相互作用关系来研究植物的抗病机制。例如，黄萎病菌诱导下陆地棉抗病品种的EST分析结果表明，当黄萎病菌侵染棉花后，植物体内发生了包括防御、次生代谢、胁迫及信号转导等系列反应［18］;再者，对海岛棉接菌诱导后根部差异表达蛋白质的分析结果同样表明，海岛棉在接菌后发生涉及初生及次生代谢等网络式反应［19］。以上研究结果均暗示抗黄萎病是一个多途径参与的复杂过程。最近，对陆地棉抗、感品种接菌后的 cDNA－AFLP分析结果表明，抗病品种 NJ0705的1个 TIRNBS－LRR类抗病蛋白质编码基因在接菌后上调表达［20］;同样，我们对野生瑟伯氏棉接菌前后差异表达蛋白质的质谱分析结果亦表明，接菌后，有 3个TIR－NBS－LRR类蛋白质点集中上调表达［21］，显示TIR－NBS－LRR基因在瑟伯氏棉抗黄萎病中可能起主导作用。

因此，对棉花抗黄萎病育种而言，选择抗黄萎病的野生棉种质资源，从中克隆NBS－LRR类抗病编码基因，进而深入研究其在抗病信号转导途径中具体作用机制，无论是对植物R基因作用机制的诠释，还是对实现棉花黄萎病的有效控制均尤为必要。本研究以抗黄萎病的瑟伯氏棉为材料，通过电子克隆等技术，对接菌试验中上调表达的3个TIR－NBS－LRR类蛋白质点的编码基因进行基因全长的克隆和分析，并对瑟伯氏棉的 TIR－NBSLRR类基因编码蛋白质在抗病反应中的可能作用机制进行讨论。

1 材料与方法

1.1 植物材料

野生棉瑟伯氏棉(G.thurberi Tod.)和戴维逊氏棉(G.davidsonii Kell.)种子由中国农业科学院棉花研究所提供。种子表面用0.1%升汞消毒液处理8 min，无菌水充分冲洗后，播种于无底纸钵内的培养土(建筑细沙∶蛭石=6∶4，事先高压灭菌)中，于人工可控温室(昼温28℃，夜温25℃，相对湿度60%)中发芽。

1.2 黄萎病菌

黄萎病大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)W菌株由河南农业大学植物保护学院提供。平板活化后，转接到查彼氏培养基，液体培养(200 r/min，25℃)10 d。经4层灭菌纱布过滤，无菌水稀释，制成1 ml 1.2×107个孢子的孢子悬液，备用。

1.3 接菌诱导

用一次性医用注射针管取15 ml孢子菌液(或无菌水)分别注入各培养皿中，让其自然吸入钵内，30 d后记录、观察对黄萎病菌的抗性表型。

1.4 RNA的提取及3'，5'RACE

总RNA提取按照天恩泽Column plant RNAout试剂盒说明书进行，cDNA第一链合成按照大连宝生物PrimescriptTMⅡ1st strand cDNA synthesis kit说明书进行。Easy－A high－fidelity PCR cloning enzyme购自 Stratagene公司;cDNA 3'－full RACE core set试剂盒、cDNA 5'－full RACE core set 试剂盒、快速连接试剂盒、Taq DNA聚合酶以及限制性内切酶等常规生化试剂均购自大连宝生物工程公司。E.coli DH5α感受态细胞购自北京百泰克生物公司;pMD18－T克隆载体购自大连宝生物工程公司。凝胶回收试剂盒、反转录试剂盒购自Promega公司。

1.5 序列分析

数据库搜索采用NCBI Blast搜索程序。利用DNAMAN软件对DNA序列进行分析和组装，利用Pf scan软件对蛋白质功能域搜寻(http://hits.isbsib.ch/cgi－bin/PFSCAN)。

2 结果与分析

2.1 瑟伯氏棉抗性接种鉴定

以感病野生棉戴维逊氏棉为对照，于温室中对两种野生棉资源接种鉴定，接菌后1个月左右观察抗性表型。接种鉴结果表明，瑟伯氏棉植株长势正常良好，表现出对萎黄病W菌系的良好抗性，而对照戴维逊氏棉植株叶片脱落，逐渐死亡(图1)。

图1 瑟伯氏棉和戴维逊棉黄萎病抗性接菌鉴定Fig.1 Disease-resistance identification of G.thurberi and G.davidsonii inoculated with Verticillium dahliae

2.2 TIR－NBS－LRR类蛋白质编码基因 GTHN1全长cDNA序列的获得

根据基因GTHN1编码区序列，分设计5'端和3'端 引 物 5'－TTAGTCTACCTAGTTGTACCAT－3'、5'－TCTCTGCAGGTAGTACAGGATTG－3'，分别与 5'、3'－full RACE core set试剂盒中的Outer及Inner引物组合，扩增GTHN1基因的5'端和3'端非编码区。扩增产物经测序、拼接后获得完整的序列;进而根据全长 序 列 设 计 引 物 (F:5'－GAGATTGAGATATCCTTCTCC－3'及 R:F:5'－TACCTTAATCAAAGTTTAAT－3')对瑟伯氏棉基因组DNA进行扩增，得到预期1 984 bp的产物(图2)。

图2 瑟伯氏棉TIR-NBS-LRR基因GTHN1的RACE和PCR扩增Fig.2 Amplification of GTHN1 gene from G.thurberi by RACE and PCR

利用NCBI中的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)工具和本地计算机DNAman软件，分析GTHN1基因的开放阅读框，得到它们的预期编码蛋白质的987个氨基酸序列(图3)。GTHN2与GTHN3分别编码 500和1 546个氨基酸(序列略)。GTHN1基因编码氨基酸序列包含1个Toll蛋白质及白细胞介素－1受 体 (Toll－interleukin－1 receptor，TIR)结 构 域、1个核苷酸结合位点(Nucleotide binding site，NBS)结构域及1个富含亮氨酸重复序列(Leucine－rich repeat，LRR)。

2.3 TIR－NBS－LRR编码基因比对与系统进化分析

3个基因全长的信息学分析结果表明，其氨基酸序列均包含1个Toll蛋白质及白细胞介素－1受体结构域、1个核苷酸结合位点结构域、1个富含亮氨酸重复序列(GTHN3无LRR功能域)及抗病基因保守的跨膜区GLPLA，其中NBS区包括典型的P－loop(Kinase－1a)、Kinase－2、Kinase－3 3 个基序(图 4)。

图4 瑟伯氏棉TIR-NBS-LRR蛋白氨基酸序列比对Fig.4 Alignment of the deduced amino acid sequences of G.Thurberi TIR-NBS-LRR genes

同类基因系统进化分析结果表明，GTHN1、GTHN2和GTHN3 3个基因聚在一起，且与其他物种同类基因进化关系较远。在11个确定的抗病基因中，亲缘关系最近的是烟草的抗病毒N基因，其次是西红柿的Bs4基因和亚麻的L6基因，而与拟南芥的RPP系列和CA1基因均较远(图5)。尽管亲缘关系有远近之别，以上基因均为典型的抗病基因，显示GTHN1、GTHN2及GTHN3亦为抗病基因，并可能在瑟伯氏野生棉应对黄萎病菌胁迫中起重要作用。

图5 不同植物TIR-NBS-LRR基因系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of the TIR-NBS-LRR genes from different plant species

3 讨论

迄今为止，大约70多个R基因已被克隆并鉴定［22］。目前，国内外研究主要集中在 TIR－NBS－LRR类抗病蛋白质各功能域的功能、抗病蛋白质编码基因之间的互作、及抗病蛋白质与上下游信号分子的识别等方面［23－25］。LRR 结构域负责首先与无毒蛋白质的识别，并决定特异抗性。TIR结构域在启动下游防御信号途径中起主要作用［26］，且该结构域多在双子叶植物中存在［27］，而单子叶植物中很少见［28］。该特点可能与双子叶植物的特异抗性有关。NBS结构域存在于真核生物的许多蛋白质中，这些蛋白质对于细胞的生长、分化、细胞骨架的形成、小泡运输和防御反应都有关键性的作用［29－30］。该特征显示NBS结构域的功能十分广泛。

有研究者指出，NBS－LRR类基因在植物基因组中呈多拷贝、且往往成簇存在［31］，这或许是植物产生应对不同病原物或同种病原物的不同小种特异抗性的遗传基础。有报道表明，众多的NBS－LRR类基因在拟南芥中呈现低水平表达，并且其中一部分呈组织特异性表达模式。在病原菌诱导下，也只是为数不多的几个NBS－LRR类基因呈现表达水平的改变，而剩余的绝大多数基因的表达水平并无变化［32］。以上报道显示，植物在某一病原物侵染下，不是一个 NBS－LRR类基因，更不是其全部 NBSLRR类基因在起作用，而是针对该病原物的特定效应因子，植物中自身有选择的几个NBS－LRR类基因在协同发挥作用，进而诱导超敏反应。例如，番茄CC－NBS－LRR蛋白质是在感知其病原菌效应因子AvrPto之前就以低聚体复合物形式存在［33］;再如，四倍体和六倍体小麦对叶锈病的抗性则需要Lr10和 LGA2 两个 CC－NBS－LRR 蛋白质的共同参与［34］。虽然 RRS1－Ws和 RPS4－Ws两个 TIR－NBS－LRR 蛋白质具体互作机制尚不清楚，但两者同时存在才赋予拟南芥对炭疽病菌的抗性［35］。

我们的研究结果亦表明，黄萎病菌W株系诱导瑟伯氏棉3个 TIR－NBS－LRR类抗病蛋白质点(双向电泳差异点)集中高调表达。因而，结合上述文献与本试验结果，我们推测在瑟伯氏棉抗黄萎病机制中的TIR－NBS－LRR类抗病蛋白质感知病菌效应因子和启动抗病转导信号途径这一最初环节是由几个TIR－NBS－LRR类基因在协同起作用，共同感知黄萎病菌效应因子并启动抗病信号转导途径。

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