周国华，姚维深，张旭

（1.南海人民医院、南方医科大学附属南海医院胸外科，广东佛山528200；2.中山大学肿瘤防治中心胸外科，广东广州510060）

Beclin1和LC3在乳腺导管癌组织中的表达

周国华1，姚维深1，张旭2

（1.南海人民医院、南方医科大学附属南海医院胸外科，广东佛山528200；2.中山大学肿瘤防治中心胸外科，广东广州510060）

目的探讨Beclinl和LC3在乳腺浸润性导管癌中的表达及两者的相关性。方法免疫组织化学EnVision法检测50例乳腺浸润性导管癌及相应癌旁组织的Beclin1和LC3表达，分析其临床意义。结果乳腺癌组织Beclin1阳性表达率[44%(22/50)]明显低于癌旁组织[100%(50/50)]，LC3阳性表达率[40%(20/50)]明显低于癌旁组织[92%(46/50)]；Beclin1和LC3表达均与患者病理分级、临床分期和淋巴结转移情况有关(P＜0.05)，而与患者年龄、绝经状况、乳头侵犯及患者ER、PR依赖性无关(P＞0.05)；Pearson相关性分析显示两者在乳腺癌中的表达无相关性。结论乳腺导管癌组织中LC3和Beclin1阳性表达率低于癌旁组织，两者可能均与乳腺癌的发生、发展相关。

乳腺癌；乳腺浸润性导管癌；Beclin1；LC3

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均呈上升趋势，发生率占女性所有肿瘤的31%，乳腺导管癌是乳腺癌常见的病理类型。自噬基因Beclinl是哺乳动物细胞中酵母ATG6基因的同源物，与磷脂酰肌醇-3-激酶（PIK3C3或Vps34）形成自噬体，在调节自噬活性参与肿瘤发生、发展中起重要作用[1]。Beclinl基因的缺失可导致自噬空泡形成减少，明显增加上皮性和造血系统恶性肿瘤的发生。微管相关蛋白LC3是酵母ATG8基因同源物，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，参与自噬体的形成[2]。本研究中我们采用免疫组织化学方法检测Beclin1、LC3在乳腺导管癌及相应癌旁组织中的表达，探讨Beclin1和LC3在乳腺导管癌发生、发展中的作用及相互关系。

1 材料与方法

1.1 材料以2009年1月至2011年8月在南方医学大学附属南海医院病理科确诊的50例乳腺癌组织标本为研究对象，所选标本均具有完整的临床和病理资料，且术前均未进行放化疗。患者年龄30～76岁，平均(47±8)岁。依恶性肿瘤UICC TNM第六版分类标准，TNM分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期14例，Ⅲ期13例，Ⅳ期3例；病理分级：Ⅰ级22例，Ⅱ级13例，Ⅲ级15例；有淋巴结转移者20例，无淋巴结转移者30例；年龄＞45岁患者23例，年龄≤45岁患者27例；已绝经患者22例，未绝经患者28例；发生乳头侵犯患者24例，未发生侵犯患者26例。取与标本对应的同期癌旁组织（癌边缘≥5 cm处）作为对照组，所有标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。

1.2 免疫组化EnVision法Beclin1鼠抗人单克隆抗体和免疫组化试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。标本经10%甲醛固定、石蜡包埋后4 μm厚连续切片后进行染色。染色步骤按试剂盒要求进行。采用双盲法随机选取10个高倍视野(×400)，每个高倍视野计数100个肿瘤细胞。观察阳性细胞所占的百分数及染色强度。对阳性细胞所占的百分数计分，以百分数＜5%=0、5%～25%=1、26%～50%=2、51%～75%=3、＞75=4。同时以染色强度无色=0、淡黄色=1、棕黄色=2、深棕色=3进行评分。最后累积积分大于3分为阳性表达，否则视为阴性表达。

1.3 统计学方法采用SPSS15.0统计软件处理数据。计数资料采用χ2检验，检验水准α=0.05。配对资料的关联性分析采用Pearson相关系数来描述，P＞0.05为差异无统计学意义。

2 结果

2.1 Beclin1和LC3在乳腺组织中的表达Beclin1主要表达于细胞浆，少量或微量表达于细胞膜，LC3主要表达于细胞浆。Beclin1和LC3在乳腺组织中的表达情况见表1。50例乳腺癌组织标本中Beclin1阳性表达率为44%，显著低于癌旁组织的100%，差异有统计学意义(χ2=38.89，P＜0.01)。癌组织中LC3阳性表达率为40%，显著低于癌旁组织92%，差异有统计学意义(χ2=30.12，P＜0.01)。

表1 Beclin1和LC3在乳腺组织中的表达[例(%)，n=50]

2.2 Beclin1和LC3表达与临床病理特征的关系不同病理分级、临床分期和淋巴结转移情况之间Beclin1和LC3表达均存在显著差异，且差异均有统计学意义。病理分级Ⅰ级Beclin1阳性表达率均明显高于Ⅱ～Ⅲ级(χ2=9.33，P＜0.01)，Ⅰ级LC3阳性表达率明显高于Ⅱ～Ⅲ级(χ2=5.97，P＜0.05)；临床分期Ⅰ期Beclin1阳性表达率明显高于Ⅱ～Ⅳ期(χ2=5.97，P＜0.05)，Ⅰ期LC3阳性表达率明显高于Ⅱ～Ⅳ期(χ2=12.15，P＜0.01)；无淋巴结转移患者Beclin1阳性表达率明显高于有淋巴结转移患者(χ2=4.88，P＜0.05)，无淋巴结转移患者LC3阳性表达率明显高于有淋巴结转移患者(χ2=5.56，P＜0.05)。癌组织中Beclin1和LC3阳性表达在不同患者年龄、绝经状况和乳头侵犯差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 Beclin1和LC3表达与临床病理特征的关系

2.3 Beclin1和LC3相关性分析Beclin1和LC3共同阳性患者10例，共同阴性者18例，LC3阳性而Beclin1阴性表达者10例，Beclin1阳性而LC3阴性者12例，Pearson相关性分析显示，两者在乳腺癌中的表达无相关性(χ2=0.49，r=0.069，P＞0.05)。

3 讨论

自噬是细胞利用溶酶体消化降解自身受损、变性或衰老的细胞器和大分子物质的生理过程[3]。在正常生理过程中，自噬有利于细胞废物清除、结构重建和生长分化；在应急状态下，自噬是细胞对不良环境的一种防御机制，可有效防止有毒或致癌损伤蛋白质或细胞器的积累抑制细胞癌变；在细胞发生癌变过程中，自噬为癌细胞生长提供丰富的营养物质促进肿瘤生长。因此，自噬在肿瘤发生、发展过程中扮演着重要的角色[4]。Beclin1与LC3都参与了细胞自噬活性的调节。Beclinl是酵母ATG6基因同源物与PIK3C3或Vps34参与形成自噬体。LC3是酵母ATG8基因同源物定位于前自噬泡和自噬泡膜表面参与自噬体形成。LC3的表达强度与自噬泡的数量成正相关，被认为是自噬体的标志分子[2]。Beclinl已被认为在调节自噬活性参与肿瘤发生、发展中起重要作用。国内李捷等[5]通过免疫组织芯片、免疫组织化学和Western blot法检测胃癌及相应癌旁组织发现癌组织Beclinl低表达(P＜0.05)，且胃癌组织中Beclinl低表达均与患者性别、分化程度、肿瘤浸润深度、淋巴结转移以及疾病分期有关(P＜0.05)。LC3表达是否与肿瘤发生、发展相关还存在争议，眭怡群等[6]通过组织芯片技术和免疫组织化学方法检测115例大肠癌中LC3表达发现，大肠癌中LC3阳性率高于大肠腺瘤和正常大肠黏膜(P＜0.01)，且与大肠癌的组织学分化程度相关(P＜0.05)。此外，赵轩一等[7]报道口腔鳞状细胞癌LC3阳性率为29.79%，显著低于癌旁组织的62.5%，并与淋巴结转移密切相关(P＜0.05)。程海燕等[8]报道宫颈鳞癌LC3阳性率为51.6%，显著低于正常宫颈组织，并与肿瘤分化和复发相关(P＜0.05)。国外Othman等[9]通过免疫组织化学检测67例乳腺癌组织发现人类LC3两个亚型LC3A和LC3B在乳腺癌组织中的表达有所差异，其中LC3A在乳腺癌组织中的阳性表达率明显高于LC3B，并认为LC3A可能在乳腺癌发生、发展中扮演更重要的角色。国内吴妍等[10]采用免疫组织化学和RT-PCR技术检测40例乳腺浸润性癌和10例乳腺非浸润性癌时，也验证了正常乳腺组织乳腺增生性病变乳腺非浸润性癌和浸润性癌4组病例中LC3A和LC3B均有不同程度的高表达，差异有统计学意义。且在乳腺癌Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级中LC3A表达依次呈递增趋势，也认为LC3A可能在乳腺癌的发生发展过程中起着重要作用。

本研究中我们检测了50例乳腺导管癌LC3和Beclin1表达发现癌组织中LC3和Beclin1阳性表达率显著低于癌旁组织，且与组织病理分级、患者临床分期和淋巴结转移情况相关(P＜0.05)。Pearson相关性分析显示，两者在乳腺癌中的表达无相关性。

综上所述，本研究初步揭示了乳腺导管癌自噬相关基因LC3和Beclin1表达情况，为进一步研究自噬活性调节机制与肿瘤发生、发展的关系提供重要方法和途径。

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Expression of Beclin1 and LC3 in the tissue of invasive ductal carcinoma

ZHOU Guo-hua1,YAO Wei-shen1,

ZHANG Xu2.1.Department of Cardiothoracic Surgery,Nanhai People's Hospital,Nanhai Hospital Affiliated to Nanfang Medical University,Foshan 528200,Guangdong,CHINA;2.Department of Cardiothoracic Surgery,Sun Yat-Sen University Cancer Center,Guangzhou 510060,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of Beclin1 and LC3 in the tissue of invasive ductal carcinoma(IDC)and to evaluate the relationship of them.MethodsImmunohistochemical method was used to determine the expression of Beclin1 and LC3 protein in 50 patients of IDC and nearby mucosa of the carcinoma.The relationship between the gene expression and clinicopathological features was analyzed.ResultsThe positive expression rate of Beclin1 in IDC(44%,22/50)was significantly lower than that in nearby mucosa of the carcinoma(100%,50/50). The positive expression rate of LC3 in IDC(40%,20/50)was significantly lower than that in nearby mucosa of the carcinoma(92%,46/50).The expression of Beclin1 and LC3 were correlated with the clinicopathological features,tissue types and neck lymph node metastasis in IDC(P＜0.05),but showed no correlation with ages,menopausal status,nipple infringement status,and the patients'ER and PR dependence(P＞0.05).The expression of Beclin1 was not correlated with the expression of LC3.ConclusionExpression of Beclin1 and LC3 is down-regulated in IDC tissues,which might be related to the tumorigenesis and development of IDC.

Breast cancer;Invasive ductal carcinoma;Beclin1;LC3

R737.9

A

1003—6350（2013）05—0630—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.05.0272

2012-10-28）

佛山市医学类科技攻关项目（编号：201208135）

姚维深。E-mail：yms7310@yahoo.com.cn