张玉芳，曲慧，单守水，郭尽力

（1.烟台汽车工程职业学院，山东 烟台 265500；2.烟台大学，山东 烟台 264000）

脂肪酶（甘油酯水解酶，EC3.1.1.1）能在异相系统的油-水界面上起催化作用，水解甘油酯、酯、硫酰键、酰胺键，在非水相中又能催化酯交换、酯化、转酯[1]等反应。近年来对很多脂肪酶在油脂的水解研究、油脂改良、酯合成、酯交换等方面的应用得到了飞速发展，特别是它们对甘油三酯的1，3 位酯键有高度的专一性而被广泛应用于结构酯的研究和生产中。

游离酶催化反应技术虽成熟但工业化成本高而难以推广，固定化是提高酶效率的更佳形式。脂肪酶的固定有多种方法，主要有吸附法、共价法、交联法、包埋法[2-3]等。由脂肪酶催化的并具有重要应用价值的酯交换和酯合成反应往往在非水有机介质中进行，而脂肪酶一般不溶于这些介质，用吸附法固定的脂肪酶在这些介质中有着比在水相中更好的稳定性，同时以吸附法固定脂肪酶还有操作简单、酶活回收率高、成本低等优点，因此吸附法是固定脂肪酶的一种重要的、更加有效的方法。硅藻土是一种用途广泛而又价格低廉的吸附载体，但还未见用于脂肪酶固定的报道。本文以硅藻土为吸附载体，对在我国有广泛资源的猪胰脂酶的固定作初步研究。为脂肪酶的工业应用提供了一些科学参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

猪胰脏：购于烟台初家肉食品加工厂；猪油：新鲜猪板油湿法熬制（烟台大学酶工程实验室自制）；花生油（精炼）：烟台正和植物油厂。

1.2 方法

1.2.1 猪胰脂酶的提取

将5 kg 新鲜猪胰去其所结合的油脂及其它组织，0 ℃捣碎成浆状。加入1 000 mL 无水丙酮，不断搅拌提取4 h～6 h，4℃，8 000 r/min 离心15 min，分离上清液。沉淀再加入1 000 mL 无水丙酮，搅拌提取4 h～6 h，离心分出液体。如此反复三四次后再加入1 000 mL 无水丙酮与乙醚的混合液（体积比1∶1）如上法进行两次提取。合并上清液，真空下干燥48 h，可得到稳定的固体粉状物。放置冰箱保存。

1.2.2 酶活力测定

以乳化状态的花生油为底物，用0.1 mol/L 的NaOH进行连续滴定，pH 保持在8.3，在37 ℃恒温下进行数分钟。读出NaOH 的体积消耗量，计算出每分钟所消耗的NaOH 的量，从而计算出酶活。

1.2.3 猪胰脂酶的固定化

称取6 g 酶加入24 mL 0.1 mol/L 的磷酸缓冲液（pH=7.5）在0 ℃下搅拌20 min，12 000 r/min 离心10 min，留上清弃沉淀。加入6 g 硅藻土搅拌1 h。加入6 mL（-20 ℃）的丙酮，搅拌15 min。用沙芯漏斗抽滤，用2×10 mL 丙酮洗两次，真空干燥箱中干燥12 h。所得固定化酶放入冰箱中储存备用。

1.2.4 酶促酯交换

称取一定量（80 mg）的固定化酶加入到10 mL 的小试管中，加入适量（2 mL）的Tris.HCl 缓冲液对酶进行活化。后加入一定量（0.1 mL）的花生油，加0.5 mL 胆酸钠，加0.2 mL 的二氯化钙在40 ℃保温水解5 min（使之完全水解）取出振荡。加入4 mL 异丙醇，加入0.3 g 猪油脂肪酸振荡，40 ℃保温30 min。取出后加入3 mL 无水乙醚。取上层液点样。

1.2.5 脂肪酸组成分析

向盛有样品的烧瓶中加入4 mL NaOH 甲醇溶液，加热回流5min～10min。加入5mLBF3甲醇溶液，加热回流1min。加入2mL～5mL 环己烷，加热回流1min。断热，加入少量饱和NaCl 溶液，振荡。加入大量饱和NaCl 至瓶颈。取上层液，加无水Na2SO4除去水分。作气相分析。

色谱条件为仪器：岛津GC—14C，检测器：氢火焰检测器（FID），色谱柱：石英毛细管（长60 m），固定液：聚乙二醇（PEG），柱温：190 ℃～210 ℃，气化室温度：250 ℃，检测器温度：250 ℃，氮气（载气）流速：30 mL/min，氢气压力：0.5 kg/cm2，空气（O2）压力：0.5 kg/cm2。

2 结果与讨论

2.1 猪胰脂酶的提取

猪胰脏提取得到提取物80 g，得率为1.6%，测得酶活为6.95 nkat。

2.2 脂肪酶的固定化及影响酶活的因素

2.2.1 脂肪酶的固定化

酶的固定化技术包括吸附、交联、共价结合及包埋等四种方法。载体的选择必须考虑以下因素：机械强度、抗微生物作用、热稳定性、化学稳定性、化学功能性、亲油/亲水特性、易再生、负载能力及其价格。选择固定化方法时要考虑总酶活，酶利用率，失活，再生特性，固定化所需费用，所用固定化试剂的毒性及其所要求的固定化酶的最终特性。硅藻土含有88%的硅及水生硅藻碎片，能溶于浓碱和氢氟酸，能吸附大于自身四倍的水，不溶于水、酸或碱。是固定化酶的理想的载体。本试验选用硅藻土作载体，通过物理吸附法固定脂肪酶。

通过固定化，得到稳定的固定化胰脂酶。固定化酶的得率为81.1%。

2.2.2 固定化酶的酶活

固定前酶活为2.55nkat，固定后酶活为4.01nkat。固定化后酶活有了较大的提高，固定化后，硅藻土作为载体将酶吸附于其上。因为其表面积较大，这样酶与底物接触的面积大大提高，从而提高了酶的催化效率，提高了酶的活性。

固定化酶的时间—NaOH 体积曲线如图1 所示。

图1 固定化酶的时间--NaOH 体积曲线Fig.1 Curve of immobilized enzyme time and NaOH

由图1 可以看出固定化酶的滴定曲线在开始一段比较接近直线，随后变化缓慢，因为固定化酶的酶表面积增大，酶的催化效率显著提高，在极短的时间内就可以将底物水解，随着底物的减少，所释放的脂肪酸减少，所消耗的NaOH 体积变小。在曲线的后半部分基本接近水平。

2.3.3 影响固定化酶活的因素

2.3.3.1 pH 对固定化酶的影响

通过固定其它条件，改变缓冲液pH，可以发现随着pH 的变化固定化酶活性相应地发生变化，见图2。

固定化酶酶活与缓冲液的pH 关系呈钟罩形曲线。因为游离态的脂肪酶的等电点5.2[4]，在pH 为6～8时其稳定性最高[5]，本试验确定pH 为6.5。

2.3.3.2 缓冲液的离子强度对固定化酶的影响

缓冲液的离子强度对固定化酶酶活的关系见图3。

图2 酶活与溶液pH 关系Fig.2 Relationship between enzyme activity and pH

图3 酶活与溶液离子强度的关系Fig.3 Relationship between activity and ionic strength

随着离子强度的增加，酶活逐渐增加，但进一步增加离子强度将导致酶活的降低[6]。在离子强度为0.03 mol/L 时，表现出最大酶活。

2.3.3.3 时间对固定化酶的影响

通过研究固定化时间对固定化酶的酶活的影响，可以发现当固定化时间为1 h 时，其酶活基本上达到最大酶活。继续延长时间对酶活影响不大。因为，酶固定化过程受载体颗粒内扩散速率控制。即酶在颗粒孔隙内迁移至吸附点，而后被固定化。显然，在经过一段时间后，酶的迁移、吸附与解析间将达到平衡。继续延长时间，将不改变其平衡状态[7]。

通过以上研究，得出酶固定化的最佳条件pH6.5，离子强度为0.03 mol/L，固定化时间为1 h。

2.4 酶促酯交换

采用花生油和猪油作为底物进行酯交换，通过气相色谱分析，得出花生油、猪油、改造油的脂肪酸的组成如表1。

表1 花生油、猪油、改造油的脂肪酸的组成Table 1 The composition of peanut oil，lard oil and transformation oil

续表1 花生油、猪油、改造油的脂肪酸的组成Continue table 1 The composition of peanut oil，lard oil and transformation oil

由表1 可知改造油的脂肪酸组成和猪油的脂肪酸组成在百分含量上较为接近，但改造油的脂肪酸的种类要比猪油的脂肪酸的种类少的多。改造油的脂肪酸组成和花生油的脂肪酸的组成相差较大。

从表1 可以看出，改造油是由花生油和猪油的脂肪酸进行的酯交换反应，在三种主要脂肪酸上，软脂酸、硬脂酸含量较猪油有提高，但基本上接近，油酸的含量有所下降，而且这三种脂肪酸含量趋向于平均化。表明该工艺制备的固定化脂肪酶可用于油脂的改性加工。

3 结论

1）猪胰脂酶固定化最佳条件为：pH 6.5，离子强度0.03 mol/L，固定化时间1 h。

2）以固定化猪胰脂酶为催化剂，以花生油和猪油的脂肪酸为底物进行酯交换，得到的改造油的脂肪酸组成和猪油较为接近，软脂酸、硬脂酸含量较猪油有所提高，油酸的含量有所下降。表明该工艺制备的固定化脂肪酶可用于油脂的改性加工。

[1]Bagi K,Simon L M.Comparison of esterification and transterification of fructose by porcine pancreas lipase immobilized on different supports[J].Biotechnology techniques,1999,13(3)：309-312

[2]Gulay Bayramoglu,Yasemin Kacar.Covalent immobilization of lipase onto hydrophobic group incorporated poly (2-hydroxyethyl methacrylate) based hydrophilic membrane matrix[J].Journal of food engineering,2002,52(4)：367-374

[3]王海雄,吴侯,翁新楚.大孔吸附树脂固定猪胰脂酶的初步研究[J].生物技术,2004,14(3)：27-30

[4]喻湘华,卓仁禧,冯俊.纳米级固定化猪胰脂肪酶催化三亚甲基碳酸酯的开环聚合研究[J].高等学校化学学报,2005,26(5)：978-981

[5]Yang Yanqing,Lowe Mark E.The open lid mediates pancreatic lipase function[J].Journal of lipid research,2000,41(3)：46-57

[6]曾俊,杨国龙,毕艳兰,等.无溶剂体系中Span 修饰的猪胰脂酶催化茶油与亚油酸酯交换[J].河南工业大学学报：自然科学版,2011,32(1)：10-13

[7]马林,徐迪,古练权.无溶剂体系中固定化脂肪酶催化的酯交换反应研究[J].中山大学学报：自然科学版,2003,42(5)：39-43