郭无瑕,李肖斐

(大连标准检测技术研究中心,辽宁大连116021)

液相色谱-串联质谱联用法测定干海参中硝基呋喃代谢物残留量

郭无瑕,李肖斐

(大连标准检测技术研究中心,辽宁大连116021)

建立了检测干海参中4种硝基呋喃代谢物的高效液相色谱-串联质谱方法。将干海参样品经过盐酸水解,以2-硝基苯甲醛(2-NBA)为衍生剂,经HLB固相萃取净化后,用高效液相色谱-串联质谱(ESI+)MRM检测,同位素内标定量。结果表明:4种硝基呋喃代谢物的线性范围均为0.5～10.0 μg/L,检出限均为0.5 μg/kg,3个水平的加标回收率为76.4% ～88.4%。该方法稳定性强、重现性好,能满足干海参中4种硝基呋喃代谢物残留检测的要求。

高效液相色谱-串联质谱法;干海参;硝基呋喃代谢物

随着中国经济的发展和人们保健意识的增强,海参的消费量急剧增加,而自然养殖海域的极大减少又刺激了海参养殖的快速和无序发展,导致其病害不断发生。海参养殖过程中长期施用抗生素,不仅会导致动物机体免疫力下降,而且还会因药物残留而危害食用者的健康。硝基呋喃类药物是一类合成的抗菌药物,因其价格低廉且疗效佳,被广泛用于畜禽及水产养殖中[1]。研究表明,此类药物及其代谢产物AOZ、AMOZ、SEM和AHD均可使实验动物发生癌变和基因突变,对人的健康造成危害[2]。欧盟和美国分别在1995、2002年全面禁止将该类药物用于食源性动物。中国也于2002年规定在所有食用动物养殖中禁止使用硝基呋喃类药物[3]。硝基呋喃类药物在生物体内代谢迅速,无法检测,而其代谢物因与蛋白质结合相对稳定,故主要利用其代谢物检测硝基呋喃类药物的残留状况[4]。硝基呋喃代谢物的检测方法主要有液相色谱法[5]、酶联免疫法[6]和液相色谱-串联质谱法[7]等,目前关于兽肉、鲜水产品中硝基呋喃代谢物检测方法的研究较多[8-10],但关于干海参中硝基呋喃代谢物检测方法的研究国内尚未见报道。本研究中,作者建立了干海参中4种硝基呋喃代谢物的高效液相色谱-串联质谱检测方法,并对样品处理方法、色谱条件、质谱条件等进行了优化。

1 材料与方法

1.1 材料

试验仪器主要有XEVO液相色谱串联质谱仪(Waters公司)、Autogizer均质仪(Tomtec公司)、SHA-C恒温振荡器(常州国华电器有限公司)、3-30K型冷冻离心机(Sigma公司)。

试验药品主要有SEM、AOZ、AHD、AMOZ标准品(Dr.Ehrenstorfer公司),SEM-13C-15N、AOZD4、AHD-13C3、AMOZ-D5内标标准品(Witega公司),2-硝基苯甲醛(百灵威科技有限公司),固相萃取柱HLB(Waters公司,3 mL,60 mg)。甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯,其余试剂均为分析纯。试验用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制 准确称取8种标准品,用纯甲醇溶解并分别稀释成100 μg/mL的储备液。将SEM、AOZ、AHD、AMOZ标准品溶液用50%(体积分数,下同)的甲醇溶液稀释成1 μg/mL的混合中间工作溶液;4种内标溶液用50%的甲醇溶液配制成20 μg/L的混合溶液。

1.2.2 色谱和质谱条件色谱条件色谱柱Waters ACQUITY BEH C18(2.1 mm×50 mm1.7 μm),柱温为40℃;流动相为超纯水(含0.1%甲酸)和乙腈(含 0.1%甲酸);梯度洗脱,流速为 0.3 mL/min,进样量为5 μL。

质谱条件电离方式有电喷雾电离(ESI)和正离子模式;雾化气温度为200℃,雾化气流速为800 L/h,反吹气流速为150 L/h;离子源温度为150℃,毛细管电压为1.5 kV;采集方式为多反应监测(MRM)(表1)。

表1 硝基呋喃代谢物的质谱测定参数Tab.1 Parameters of mass spectrometry for detection of nitrofuran metabolites

1.2.3 样品处理 准确称取1.0 g干海参样品置于离心管中,加入100 μL 20 μg/L的内标混合溶液和20 mL 0.2 mol/L的HCl,使溶液中盐酸的量为0.2 mmol/mL(必要时用浓盐酸调节),再加入0.5 mL新配制的0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛(2-NBA)溶液,均质后于37℃水浴中振荡过夜。取出后加入2 mL 0.1 mol/L K2HPO4溶液,用1 mol/L NaOH溶液调节溶液pH为7.4,以12 000 r/min离心3 min。取上清液过固相萃取柱(HLB),依次用5 mL甲醇、10 mL水活化,当样品全部通过固相萃取柱后用10 mL水洗涤,用真空泵将柱抽干。用4 mL乙酸乙酯洗脱,收集洗脱液并将其在40℃下用氮气吹干,用20%的乙腈溶液溶解并定容至1.0 mL,混匀后过0.2 μm有机相滤膜,以备测定。

2 结果与讨论

2.1 样品处理条件的优化

干海参中硝基呋喃代谢物以蛋白结合物的形态存在于机体组织中,只有在酸性条件下通过水解才能释放出来。样品在酸水解过程中,溶液的pH值极大地影响水解和衍生效率。部分干海参样品呈碱性,在加入盐酸后会消耗一定量的盐酸,导致酸度不够、回收率较低。本试验结果表明,当溶液中盐酸的量达到0.2 mmol/mL时水解完全、回收率较高。因此,在实际检测中处理呈碱性的海参样品时应使用浓盐酸调节,使溶液中盐酸量达到 0.2 mmol/mL,这样才能使样品水解完全,重复性好。

2.2 色谱条件的优化

用色谱柱进行分离时待测物在3 min内全部出峰。分别考察以乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水、甲醇-水作为流动相,对灵敏度和分离度的影响。结果表明,采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱时,对4种硝基呋喃代谢物的衍生物有较好的色谱分离和分析灵敏度。

2.3 质谱条件的优化

将4种硝基呋喃代谢物标准溶液1 μg/mL用2-硝基苯甲醛衍生,得到相应的衍生溶液。采用流动注射方式以0.3 mL/min流速分别将4种硝基呋喃代谢物的衍生物注入离子源。在正离子检测方式下分别对其进行一级质谱分析得到母离子峰,再对母离子进行二级质谱分析(子离子扫描),得到碎片离子信息和二级质谱图,然后再对锥孔电压、碰撞电压等参数进行优化,使母离子与特征碎片离子强度达到最大,确定最佳质谱参数如表1所示。

2.4 线性范围和检出限

分别吸取适量的混合中间工作溶液,用50%甲醇稀释, 使终浓度为 0.5、1.0、2.0、4.0、10.0 mg/L,并加入100～120 mg/L的内标混合溶液。以标准物质浓度与内标浓度比为横坐标,以标准物质峰面积与内标峰面积比为纵坐标,进行线性回归,得到各标准物质的回归方程和相关系数,结果呈良好的线性关系;以噪音响应的3倍来测定各标准物质的检出限,SEM、AOZ、AHD、AMOZ的检出限均为0.5 mg/kg(表2)。

2.5 检测方法的回收率和精密度

取空白干海参样品进行3个水平的加标试验,加标浓度分别为 0.5、1.0、4.0 mg/kg,按照“1.2.3”节中的方法处理样品后进行测定,测得4种硝基呋喃类代谢物的平均回收率为76.4% ～88.4%,各组分的回收率和精密度结果见表2。表明该方法稳定性强、重现性好,能满足干海参中4种硝基呋喃类代谢物残留检测的要求。

综上所述,本研究中建立的测定方法步骤简单、回收率高、精密度良好,为干海参中硝基呋喃类代谢物残留量的检测提供了一个准确、易操作的科学方法,为政府执法部门开展风险监控工作提供了有力的技术支持。

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Determination of antibiotics nitrofuran metabolites in dried sea cucumber by HPLC-MS/MS

GUO Wu-xia,LI Xiao-fei
(Dalian Center of Standard Detection Technology,Dalian 116021,China)

A method for detection of 4 metabolites of antibiotics nitrofuran was developed in dried sea cucumber by HPLC-MS/MS.Samples of the dried sea cucumber were hydrolyzed by hydrochloric acid and derived with 2-nitrobenzaldehyde,was purified by HLB solid-phase extraction,and analyzed by HPLC-MS/MS(ESI+)using multiple reaction monitoring(MRM)in which the quantitative analysis was carried out by isotope internal standard dilution technique.The metabolite levels of antibiotics nitrofuran were shown a good linear relationship over the concentration ranging from 0.5 μg/L to 10.0 μg/L,with the detection limit of 0.5 μg/kg,and average recovery from 76.4%to 88.4%,indicating that the method has strong stability,good reproducibility,and meet the requirements for detection of nitrofuran metabolites in dried sea cucumber.

HPLC-MS/MS;dried sea cucumber;nitrofuran metabolite

TS254.7

A

2013-10-10

国家质检总局科研计划项目(2013QK176)

郭无瑕(1982-),女,硕士,工程师。E-mail:13591322829@139.com

2095-1388(2013)06-0614-03