王昱超，穆常青，郭晓军，王 甦，田兆丰，姚 晶，罗 晨*，孙跃先

(1.云南农业大学植保系，昆明 165020;2.北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京 100097;3.北京市植物保护站，北京 100029)

烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)属半翅目Hemiptera 粉虱科Aleyrodidae 小粉虱属Bemisia，是农业及园艺作物的主要害虫之一。烟粉虱除通过取食寄主汁液、分泌蜜露造成植物危害外，传播多种植物病毒也是重要方式之一(Brown，1994;Jone，2003)。研究表明，目前全世界已知报道烟粉虱有至少35个隐种，其中 MED(Mediterranean)(Q 型)和MEA1(Middle East－Asia Minor 1)(B 型)是入侵我国重要的烟粉虱隐种，常混合发生，并对我国农业造成了不同程度的危害和损失(De Barro et al.，2011;Hu et al.，2011)。而MED 自2006年入侵我国后，危害更为严重、寄主谱更广、易产生抗药性，且传播双生病毒，防治上更为困难(褚栋等，2005;Luo et al.，2010)。

番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus，TYLCV)是世界范围内流行的一种毁灭性双生病毒，首次在我国报道检测出后，在我国番茄主要产区流行发生，并造成严重经济损失(Wu et al.，2006)。研究表明，MED 是双生病毒传播的重要媒介，除在植物与烟粉虱之间直接传播外，还可通过烟粉虱交配及产卵携带等方式在个体和代别间进行传播(纠敏等，2006;Brown，2010)。TYLCV 对MED 生理学影响的研究，仅见报道有关于带毒植株对烟粉虱的产卵量影响，MED 在发病番茄上的产卵量比健康番茄上略高，但结果差异不显著(李萌等，2010)。通过直接观察感染TYLCV 后烟粉虱取食行为的影响和变化的研究，鲜有报道。

烟粉虱作为一种刺吸式口器昆虫，其在口针刺入植物体内后，在外部很难知道其具体的取食行为及变化。刺吸电位技术(Electrical penetration graph，EPG)的运用，为研究昆虫口器在寄主体内的取食及相关行为提供了较好的技术手段(McLean et al.，1965;Kimmins et al.，1985;汤清波等，2011;赵秋剑等，2011)。目前，EPG 技术在蚜虫取食行为的研究领域，获得了非持久性病毒pd 波的分析。棉蚜获毒发生在pd 波的Ⅱ－3 阶段，支持了蚜虫获毒的“吸入假说”，且pdⅡ－2的持续时间可以作为棉蚜传毒的指标(张鹏飞等，2001;王斌等，2003;Tjallingii et al.，2010)。EPG技术在烟粉虱取食行为的研究起步较晚，Johnson等(1999)比较了烟粉虱与蚜虫pd 波的差异，发现了一些不同，成功将EPG 技术应用到烟粉虱的研究。Jiang 等(1999)则将MED和MEA1 的取食波形进行了比较，发现其在一些与韧皮部有关的参数上存在差异。而后的研究结果多集中在不同隐种烟粉虱对寄主植物适应性以及寄主植物抗性等方面。目前，关于烟粉虱和双生病毒的协同进化研究正在逐步成为热点。本文利用EPG 技术研究了感染和未感染TYLCV 的MED 隐种在番茄上的取食波形差异，并对烟粉虱取食行为不同阶段的时间评价指标结果进行了比较和分析，探究TYLCV 对烟粉虱取食行为的影响，为深入研究烟粉虱—寄主植物—病毒三者间的相互关系奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 植物和昆虫

供试番茄Lycopersicon esculentum Mill.品种为仙客6 号，购于北京京研益农科技发展中心，田间观察为对TYLCV 敏感。恒温箱内培育净苗(26±0.3℃、RH60%±5%，光照L∶D=14∶10)，长至3～4片真叶时用于试验。

烟粉虱采自于北京市农林科学院温室，室内置于笼内以无毒番茄植株饲养续代，所获种群经鉴定为MED 隐种。利用感病番茄植株获得感染TYLCV 的MED种群，实验所用带毒烟粉虱均为感病番茄饲养48 h 后的烟粉虱，方法为:将有伪蛹的叶片剪下，置于有滤纸保湿的培养皿中，待羽化后，将初羽化的烟粉虱放入养虫笼内取食获毒。

1.2 EPG 记录

成虫的EPG 试验主要分为四个步骤:第一步是将金丝粘连到铜钉上，金丝直径为12 μm;第二步是将粉虱固定在培养皿底部;第三步是用金丝粘连粉虱;第四步是放置粉虱。各步骤详见岳梅等(2005)。将烟粉虱放置于叶片背面，将铜钉插入探头，开始试验记录。每头粉虱只用于一个记录，每株植株仅用一次，感染和不感染TYLCV 的MED 隐种试验个数分别为60和40头，记录时间为6 h。

EPG 信号放大器为荷兰瓦格宁根大学昆虫学实验室研制的Giga－4 型放大器，负责把从探头进来的电信号转换为数字信号的是一个转换器(DI－720，DATAQ INSTRUMENTS)，连于放大器和电脑之间支持软件为转换器自带的分析软件(WINDAQ)。刺探电位信号首先记录、保存到计算机硬盘上，然后用分析软件对波形进行识别和分析。

烟粉虱传毒主要在韧皮部刺吸的过程，其口针在不同部位对应的EPG 波形也各不相同。EPG各种波形的生物型意义参见高庆刚等(2006)。本实验将整个纪录过程分为三个阶段:第一阶段从刺吸开始到第一个E1(韧皮部分泌波形)出现;第二阶段从第一个E1出现到第一次韧皮部持续取食;第三阶段从第一次韧皮部持续取食到取食结束，选取12个指标进行分析，具体方法参见岳梅(2005)。

1.3 烟粉虱带毒检测

EPG 试验过后对单头烟粉虱分别进行TYLCV带毒检测，鉴定方法采用田兆丰等(2011)的方法。PCR 检测步骤如下:首先提取昆虫DNA 作为PCR反应体系的模板，采用1.5mL 的离心管依次加入ddH2O 25μL、10 X buffer 5μL、蛋白酶K 1.2μL、吐温20 0.225μL和NP40 0.225μL 后研磨煮沸离心的方法。PCR 扩增引物序列为:Primer 1:5'－CCA ATA AGG CGT AAG CGT GTA GAC－3'Primer 2:5'－ACGCATGCCTCTAATCCAGTGTA－3';PCR 扩增体系:模板1μL、Primer 1 1μL、Primer 2 1μL、2×Master Mix 10.51μL，加ddH2O 至体积为20μL。PCR反应程序:94℃预变性2 min;94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸30 s，共32个循环;72℃延伸10 min，4℃保存。反应完毕后，从PCR 产物中取5μL 电泳检查扩增结果，合成序列大小应为500 bp 左右。

1.4 统计分析

应用统计软件为SPSS16.0 for windows。感染和未感染TYLCV 的MED 隐种在番茄上的取食差异利用独立样本的T 检验，两组的显著性差异均设为P=0.05 水平。

2 结果与分析

2.1 烟粉虱的病毒检测结果

从电泳结果可看出，用于实验的感染TYLCV的MED 隐种均能检测到为500 bp 左右的PCR 产物，而未感染病毒的烟粉虱均检测不到相应条带(图1)。

图1 MED 烟粉虱带毒检测结果Fig.1 Detection of virus from MED Bemisia tabaci

2.2 烟粉虱的波形结果

烟粉虱的波形共记录到6种，分别A、B、C、E、pd和np 波(图2)，典型波形见岳梅等(2005)。

烟粉虱口针位于表皮和韧皮部之间的取食行为比较结果如表1。带毒和不带毒的烟粉虱的平均刺探次数和短于2 min 的平均刺探次数，即口针在刺探过程中进入叶肉细胞的次数没有显著的差异;而非刺探时间所占的比例，即在到达韧皮部之前非刺探行为占整个取食时间的比例，带毒和不带毒MED 分别平均为92%和76%，没有显著差异(P=0.187)。口针第一次到达韧皮部所用时间，带毒和不带毒MED 平均为135 min和26 min，差异非常显著(P=0.001)。从口针开始刺探至到达韧皮部，带毒MED 平均用时为46 min，要明显的长于不带毒MED 平均时间20 min。

图2 烟粉虱典型波形(a)非刺探波形与C 波的转换(50×);(b)路径波C 与E 波的转换(50×);(c)韧皮部分泌唾液波形E1(1×);(d)韧皮部取食波形E2(1×)。Fig.2 Representative EPG waveform of B.tabaci(a)Transform between waveform non－pierce and C(50×);(b)Trarsform between waveform C and E(50×);(c)Secretion waveform E1 on phloem(1×);(d)Feeding waveform E2 on phloem(1×).

表1 感染和未感染病毒的烟粉虱在植株上从刺探开始到第一次到达韧皮部的过程Table 1 Probing and feeding behaviors of Bemisia tabaci infected and uninfected with TYLCV from the start of penetration to achieving phloem on tomato

烟粉虱口针第一次到达韧皮部至第一次韧皮部持续取食阶段结果如表2。不带毒MED 中有19头可以在韧皮部持续取食;而带毒MED 有15头可以在韧皮部持续取食。这一阶段所用平均时间，带毒MED 的平均时间(34 min)要长于不带毒MED(14 min)，且具有显著的差异(P=0.002)。在整个纪录中从记录开始至第一次韧皮部持续吸食所用的平均时间，即吸食之前口针刺探与非刺探的时间，两者具有显著差异(P=0.001)，带毒MED 的平均时间(143 min)，而不带毒MED 平均时间仅为26 min。同时，第一次持续吸食前的韧皮部唾液分泌总平均时间，带毒MED(9 min)要长于不带毒MED(3 min)，差异显著(P=0.021)。

烟粉虱在第一次韧皮部持续吸食到取食行为结束阶段结果如表3。带毒MED 取食平均时间(15 min)显著(P=0.001)长于未带毒MED(4 min)。两者在第一次到达韧皮部即能持续吸食(即第一次韧皮部分泌唾液后就取食)的烟粉虱比例、第一次韧皮部持续吸食后，韧皮部取食时间所占取食总时间的百分比和第一次韧皮部持续吸食后的刺探次数这四项参数均没有表现出显著差异。

表2 感染和未感染病毒的烟粉虱在植株上从第一次到达韧皮部至第一次韧皮部持续吸食的过程Table 2 Probing and feeding behaviors of Bemisia tabaci infected and uninfected with TYLCV from the 1st phloem phase to the 1st sustained phloem ingestion on tomato

表3 感染和未感染病毒的烟粉虱在植株上从第一次韧皮部吸食至取食结束的过程Table 3 Probing and feeding behaviors of Bemisia tabaci infected and uninfected with TYLCV from 1st sustained phloem ingestion to the end of feeding on host plants

3 结论与讨论

关于植物病毒的研究往往局限于研究病毒引起植物生理行为的改变，从而间接改变传毒昆虫介体的趋向性。植物感染番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)会吸引西花蓟马雌成虫的取食和产卵，但是，病毒也会对昆虫本身的取食行为产生影响(Stafford et al.，2011)。利用EPG 研究带毒MED 取食波形的结果表明:带毒MED 完成一次取食行为的总时间较未带毒MED 的时间显著增长，主要表现在非刺探时间和韧皮部分泌取食阶段时间的显著差异。

在非刺探阶段，带毒与不带毒MED个体取食过程中，平均刺入叶肉细胞的次数没有显著差异，但在口针穿过表皮—叶肉组织平均时间显著长于不带毒个体。而已有研究结果表明:到达韧皮部前的刺探次数与植物表皮—叶肉组织的抗性有关(Gabrys et al.，1997)，因此可以排除寄主植物物理抗性对非刺探行为的影响。根据Cohen(1998)的研究，烟粉虱取食时其所有的唾液鞘都伸向维管束，98% 的唾液鞘抵达了小叶脉;严盈等(2008)烟粉虱在韧皮部顺利取食必须要在筛管外形成唾液鞘来抑制植物的虫伤反应，以达到顺利取食的目的。以上研究结合带毒MED 非韧皮部刺探时间的延长，均表明TYLCV 对烟粉虱在健康番茄上口针由叶表到韧皮部的刺探过程可能具有不利作用的，可能是影响了其唾液鞘的形成。但是Stafford 等(2011)得出感染TSWV 的蓟马在非韧皮部刺探时间增长能够促进TSWV 的传播，表明非韧皮部刺探时间的延长可能促进了TYLCV 的传播。

在韧皮部吸食阶段，带毒MED个体的各指标平均用时均长于不带毒MED个体。唾液分泌总平均时间与烟粉虱的传毒有较高的关联性，主要表现在烟粉虱体内的病毒伴随唾液进入了植物韧皮部内，而回归分析表明传毒效率与韧皮部分泌波形的总数目和波形持续时间高度关联，并认为含有韧皮部唾液分泌波形和韧皮部持续吸食波形持续时间与次数增加，具有较高的传毒效率(Jiang等，2000)。本试验验证了带毒烟粉虱个体韧皮部分泌波形平均持续时间显著长于不带毒烟粉虱个体。在对柑橘木虱的传毒研究中，黄龙病也具有韧皮部限制性，韧皮部分泌和取食波形的变化能够影响病毒的获得和传播(Bonani et al.，2010)。在韧皮部取食阶段，第一次韧皮部持续吸食所用平均时间，带毒MED 平均用时显著长于不带毒MED。可以看出韧皮部分泌和取食波形与传毒效率的提升有很重要的相关性。而本试验得出带毒MED 韧皮部取食波形平均时间显著长于不带毒MED，即韧皮部取食平均时间长于不带毒烟粉虱个体，更利于病毒在烟粉虱在植物体内的传播。因此，从本研究结果判断，TYLCV 能够使烟粉虱个体在韧皮部持续吸食时间增长，有利于烟粉虱种群的扩大;而烟粉虱种群的扩大则更有利于病毒的扩散传播。

对非韧皮部阶段MED 口针活动的推测需要结合口针切片或蜜露分析技术，并且对非韧皮部指标进行更详细的分析，才能得出准确的结论。

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