简红朱雷邵晋辰赵艺李传佳虞永锋张杰

1.上海交通大学附属上海市胸科医院肺部肿瘤临床医学中心，上海200030；

2.上海交通大学附属上海市胸科医院病理科，上海200030

ERα、ERβ在非吸烟非小细胞肺癌患者中的表达与生存期和性别的相关性研究

简红1朱雷2邵晋辰2赵艺1李传佳1虞永锋1张杰2

1.上海交通大学附属上海市胸科医院肺部肿瘤临床医学中心，上海200030；

2.上海交通大学附属上海市胸科医院病理科，上海200030

背景与目的：雌激素信号传导在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中存在争议，体外实验发现，雌激素受体(estrogen receptor，ER)ERβ与肺内组织的异常增生相关，ERβ在正常组织和肺癌组织中的表达结果不同。本研究旨在探讨ERα和ERβ在非吸烟NSCLC患者中的表达与临床病理特征和生存期的关系。方法：收集有组织学病理诊断的144例非吸烟的NSCLC组织及其临床资料，免疫组化方法检测ERα和ERβ表达状况并分析与临床特点和生存期的关系。结果：ERα阳性表达率为7.6%，仅在腺癌中表达，ERα表达状态与生存期无关。ERβ表达率为52.1%，Ⅰ、Ⅱ期患者的表达显著高于Ⅲ、Ⅳ期，差异有统计学意义(P=0.020)。ERβ表达阳性和阴性的中位生存期(median survival time，MST)分别为43和38个月，差异有统计学意义(P=0.028)，ERβ表达阳性和阴性的女性MST分别为45和37个月，差异有统计学意义(P=0.033)。在腺癌中ERβ阳性和阴性表达的MST分别为46和38个月，差异有统计学意义(P=0.021)。结论：ERβ在早期非吸烟NSCLC中表达增高，是女性、腺癌生存期良好的标志。

非吸烟；非小细胞肺癌；雌激素受体

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)至今仍是恶性肿瘤致死的主要原因，吸烟已被证实为NSCLC发病的主要原因，但近20年的流行病学研究显示，随着烟草控制的深入，与吸烟相关的男性肺癌发病率从90年代起在缓慢下降，女性肺癌的发病率和病死率在持续上升［1-2］，其中腺癌的比例明显增高。驱动基因研究显示在非吸烟、腺癌中EGFR突变的比例比正常肺癌人群显著增高，且女性的比例明显高于男性，并对EGFR的酪氨激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKI)敏感［3］。研究显示，女性肺癌的临床特征和生存期与男性肺癌不同［4］，体外研究显示雌激素受体(estrogen receptor，ER)与肿瘤的增殖有关，但在临床研究中ER与NSCLC患者的生存期的关系尚无明确的结论，且是否与研究的人群过于宽泛有关尚不清楚。本研究旨在分析非吸烟NSCLC患者ERα、ERβ的表达与生存期和性别的关系，以期为临床治疗提供依据。

1 资料和方法

1.1 研究对象

收集上海胸科医院2009年7月—2010年7月手术切除的原发性初治非吸烟的NSCLC患者，共144例。患者术前均行胸部CT、头颅CT、骨ECT、腹部B超或全身PET检查；术式为肺叶或全肺切除术加系统淋巴结清扫术；术后分期依照国际肺癌研究协会(IASLC)2009年的标准，病理分型按WHO/IASLC组织学分类(2004)标准，随访生存期至2013年7月。将治疗分为单纯手术、手术联合化疗、手术联合化疗及TKI治疗3组。

1.2 ERα、ERβ免疫组化分析

手术标本经4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋。选取肿瘤组织丰富的石蜡块连续切片(4 μm)。其中1张行常规HE染色，证实为NSCLC；另取2张分别用ERα、ERβ单克隆抗体进行免疫组化染色，1张备用。此外，还包括ERα兔抗人多克隆抗体(1∶50，clone 6F11；Novocastra laboratories)、ERβ (1∶50，clone 14C8；GeneTex Inc)、EnVision试剂(美国DAKO公司)。

组织切片经二甲苯脱蜡3次，每次20 min，梯度乙醇水化后蒸馏水冲洗3次。PBS冲洗，3%过氧化氢甲醇溶液处理。加1滴或50 μL非免疫性动物血清10 min，按照产品指南的方法及要求加入单克隆抗体作为一抗，室温下温育24 h。PBS冲洗，加100 μL二抗，室温下温育1 h。PBS冲洗，每次5 min，共冲洗3次。滴显色剂，室温下温育10 min。苏木精套色5 min，冲洗20 min。1%盐酸酒精分化，冲洗20 min。切片经95%，100%乙醇各两档脱水，二甲苯透明中性树胶封片。ER用乳腺癌标本作为阳性对照。

采用免疫组化二步法EnVision System方法检测ER的表达，采用Olympus光学显微镜以200倍观察切片。ER蛋白阳性细胞为细胞核呈棕黄色，细胞质和细胞膜不着色，高倍镜下随机选择5个视野，每个视野记数100个细胞，计算阳性细胞百分比≥10%者为蛋白表达阳性。

1.3 统计学处理

统计软件为SPSS 19.0，应用描述性统计，χ2检验，Kaplan-Meier分析ERα、ERβ的表达、性别、临床特点、治疗方法等因素与中位生存期(median survival time，MST)的关系，COX多因素分析生存期。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 非吸烟NSCLC患者的基本情况及ERα、ERβ表达状况

144例非吸烟NSCLC患者中男性49例，女性95例，年龄28～75岁，平均57.6岁，中位年龄59岁。腺癌109例，鳞癌24例，鳞腺癌10例，大细胞癌1例。Ⅰ期64例，Ⅱ期24例，Ⅲ期41例，Ⅳ期15例。单纯手术34例，手术联合化疗40例，手术联合化疗及TKI治疗的共70例，随访至2013年7月。ERα、ERβ阳性表达分别为7.6%和52.1%。全组患者的MST为42个月，男性为38(32.80～43.20)个月，女性44(39.3～47.4)个月，差异无统计学意义(P=0.434)。

2.2 非吸烟NSCLC患者ERα、ERβ表达与临床病理特征的关系

144例非吸烟NSCLC患者中ERα阳性表达11例，仅为7.6%，表现为细胞核呈棕黄色染色(图1A)。男性和女性的表达率差异无统计学意义(P=0.623)。ERα仅在腺癌中表达(10.1%)，鳞癌、鳞腺癌、大细胞癌未见阳性表达。Ⅰ～Ⅳ期患者中ERα的表达率差异无统计学意义(P=0.800，表1).

144例非吸烟NSCLC患者中75例(52.1%)患者ERβ呈阳性表达，细胞核内呈棕黄色染色(图1B)。男性和女性的表达率差异无统计学意义(P=0.593)。ERβ在腺癌中表达率为51.4%，鳞癌为54.2%，鳞腺癌为50%，大细胞癌为100%，差异无统计学意义(P=0.801)。Ⅰ～Ⅳ期患者中ERβ表达差异有统计学意义(P=0.020，表1)。

图 1 ERα及ERβ患者在非吸烟NSCLC中的表达Fig. 1 Expression of ERα in non-smoking NSCLC patients (DAB, ×200)

表 1 非吸烟NSCLC患者ERα、ERβ表达与不同性别、病理分型及分期的关系Tab. 1 The relationship between the expressions of ERα and ERβ in non-smoking NSCLC and different gender, pathological types and stage

2.3 ERα、ERβ表达与非吸烟肺癌生存期和性别的关系

随访至2013年7月，随访期为48个月，144例非吸烟NSCLC患者的MST为42个月，男性为38个月，女性44个月，差异无统计学意义(P=0.434)。病理类型差异无统计学意义(P＞0.05)，分期显示Ⅰ期和Ⅱ期的生存期明显优于Ⅲ期和Ⅳ期，差异有统计学意义(P＜0.05)。单纯手术组生存期优于手术联合化疗及TKI组，而手术联合化疗及TKI组生存期优于手术联合化疗组，差异有统计学意义(P＜0.05，图2)。ERα阴性表达的MST为41个月(95%CI：36.34～45.66)，ERα阳性表达的MST为45个月(95%CI：30.33～59.66)，尽管ERα阳性表达的生存期优于ERα阴性表达，但差异无统计学意义(P=0.671)。进一步分析ERα表达阳性的患者生存期与性别、病理类型和分期的关系，因阳性表达率低，SPSS无法给出MST。

144例非吸烟NSCLC患者中ERβ阳性表达为52.1%，其阳性表达的MST为43(38.74～44.06)个月，明显高于阴性表达的38(35.33～40.67)个月，差异有统计学意义(P=0.028)。男性患者ERβ表达阳性和阴性的MST分别均为45和38个月，差异无统计学意义(P＞0.05)，而女性患者ERβ表达阳性和阴性的MST分别均为45和37个月，差异有统计学意义(P=0.033)。在腺癌患者中，ERβ表达为阳性和阴性的MST分别为46和38个月，差异有统计学意义(P=0.021)；鳞癌、腺鳞癌患者的MST与ERβ的表达状态之间差异无统计学意义(P＞0.05)。ERβ表达状态在不同的治疗组中差异无统计学意义(P＞0.05，表2)。多因素分析生存期仅与分期相关，Ⅰ期、Ⅱ期是生存期延长的主要因素(表3，图2)。

图 2 144列患者不同因素影响下的生存期分析Fig. 2 The survival curves of 144 patients by different factors

表 2 非吸烟NSCLC患者ERβ表达与生存期的关系Tab. 2 Expressions of ERβ in non-smoking NSCLC and the correlation with median survival time (MST)

表 3 多因素分析总生存期相关数据Tab. 3 Multivariate analysis of overall survival

3 讨 论

Chaudhuri等［5］研究发现，肺癌组织中存在ER，现已知ER有ERα、ERβ两种亚型；通过体外实验发现，雌二醇对肺癌细胞株和正常肺纤维细胞有增殖效应，用雌二醇进行温育，肺癌传代细胞株增殖增加17倍，而正常肺纤维细胞增殖增加仅3.8倍，提示恶性细胞对雌激素的反应更敏感。有研究发现，早期绝经的妇女患肺腺癌的风险下降，而雌激素替代治疗的患者肺癌发病风险明显升高，女性绝经前较绝经后更易患广泛性的病变和腺癌，绝经前肺癌患者相关病死率与年轻男性相似，而绝经后女性患者的病死率低于老年男性［6-8］。雌激素的致癌作用与雌激素代谢过程中产生的中间产物有关，这些产物可使DNA损伤、断裂，导致基因突变。雌激素在生理浓度下并不产生致癌结果，但在较高的浓度下，在具有儿茶酚雌激素合成酶系和(或)灭活儿茶酚雌激素的酶系活性低下的器官则可能发生肿瘤。其促进雌激素依赖性肿瘤的增殖可通过以下机制：①调节与细胞分裂有关的早期基因，如c-myc、c-jun和c-fos的表达，促进DNA合成和细胞分裂；②调节与细胞周期有关的调节蛋白，如cyclin B2的表达而影响细胞的增殖；③刺激生长因子如表皮生长因子、胰岛素样生长因子Ⅱ、转化生长因子-α的表达而促使细胞增殖［9-12］。

本研究结果提示，在非吸烟NSCLC中，ERα和ERβ的表达状况是不同的，ERα阳性表达率为7.6%，仅在腺癌中表达，在鳞癌、鳞腺癌、大细胞癌中无表达。尽管ERα阳性表达的患者生存期优于阴性患者，然而其由于表达率低，差异无统计学意义(P＞0.05)。而ERβ表达率为52.1%，Ⅰ、Ⅱ期患者表达明显高于Ⅲ、Ⅳ期。ERβ阳性表达为预后良好，ERβ阳性和阴性表达患者的MST分别为43和38个月，差异有统计学意义(P=0.028)。ERβ表达与性别相关，其表达阳性和阴性的女性患者MST分别为45和37个月，差异有统计学意义(P=0.033)，ERβ表达阳性和阴性的腺癌患者MST分别为46和38个月，差异有统计学意义(P=0.021)。由此可见，非吸烟NSCLC患者ERβ阳性表达主要发生在肺癌早期，是女性腺癌预后良好的标志。ERβ表达状况在不同的治疗组中生存期差异无统计学意义，预示其并不是一个预测疗效的指标。多因素分析结果显示，影响生存期的因素仅为分期。

Siegfried等［13］的研究结果显示，ERβ在肺癌组织中的表达率为40%～69%，Mohit等［14］报道为87.5%，Li等［15］报道为89.0%，均显著高于本研究的结果，究其原因为本组患者为非吸烟NSCLC，女性占66%，Ⅰ、Ⅱ期患者占61.7%，为相对预后良好的人群。Navaranam等［16］报道了一项75%为早期患者的研究，其ERβ阳性率为51%，而在相对晚期的BR18的人群中为49%，对于ER的表达是否与性别、病理类型呈正相关，目前尚无统一的观点。Wu等［17］采用免疫组化方法研究301例Ⅰ～Ⅲ期NSCLC患者手术切除标本的ERβ表达，结果显示，女性患者的阳性率为53%，高于男性的39.7%(P=0.012)，并发现ERβ表达与患者的生存期明显相关，是预后良好的标志。然而这一结果并没有被广泛验证，大量的研究仍局限在ER的表达水平。Navaratnam等［16］的研究结果显示，在早期和晚期NSCLC患者中，ERβ的表达情况对应着不同的生存期，早期肺癌中无论单因素还是多因素分析结果均显示，ERβ是预后良好的标志，而在晚期患者中，ERβ是预后不良的标志，可能是因为肿瘤在不同期别信号传导因子的活性和通路不同，如TGFβ家族在乳腺癌进展中会出现不同亚基的表达，导致ERβ在功能上担任不同信号传导机制的活性分子。ER调节多种信号因子，在肺腺癌中调节MK蛋白的表达从而调控EMT促进转移，而ERβ与芳香化酶有高度一致的协同表达，与肺癌性别依赖的生存优势密切相关。鉴于ER的复杂性，有必要按不同人群、期别进行研究。

［1］ JEMAL A, SIEGEL R, XU J, et al. Cancer statistics, 2010［J］. Cancer J Clin, 2010, 60: 277-300.

［2］ JEMAL A, THUN M J, RIES L A, et al: Annual report to the nation on the status of cancer, tobacco use, and tobacco control［J］. J Natl Cancer Inst, 2008, 100: 1672-94.

［3］ MOK T S, WU Y L, THONGPRASERT S, et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma［J］. N Engl J Med, 2009, 361: 947-957.

［4］ JIAN H, ZHAO Y, LIAO M L, et al. The analysis of clinic characteristic and survival by gender in resected NSCLC［J］. China Oncol, 2012, 22(11): 825-830.

［5］ CHAUDHURI P K, THOMAS P A, WALKER M J, et al. Steroid receptors in human lung cancer cytosols［J］. Cancer Lett, 1982, 16(3): 327-332.

［6］ ADAMI HO, PERSSON I, HOOVER R, et al. Risk of cancer in women receiving hormone replacement therapy［J］. Int J Cancer, 1989, 44: 833-839.

［7］ SCHWAARTZ A G, WENZLAFF A S, PRYSAK G M, et al. Reproductive factors, hormone use, estrogen receptor expression and risk of non-small cell lung cancer in women［J］. J Clin Oncol, 2007, 25(36): 5785-5792.

［8］ GRIDELLI C, LANGER C, MAIONE P, et al. Lung cancer in the elderly［J］. J Clin Oncol, 2007, 25: 1898-1907.

［9］ TANG H, LIAO Y, CHEN G, et al. Estrogen upregulates the IGF-1 signaling pathway in lung cancer through estrogen receptor-β［J］. Med Oncol, 2012, 29(4): 2640-2648.

［10］ ZHAO G, NIE Y, LV M, et al. ERβ-mediated estradiol enhances epithelial mesenchymal transition of lung adenocarcinoma through increasing transcription of midkine［J］. Mol Endocrinol, 2012, 26(8): 1304-1315.

［11］ GARON E B, PIETRAS R J, FINN R S, et al. Antiestrogen fulvestrant enhances the antiproliferative effects of epidermal growth factor receptor inhibitors in human non-small-cell lung cancer［J］. J Thorac Oncol, 2013, 8(3): 270-278.

［12］ TANG H, LIAO Y, XU L, et al. Estrogen and insulin-like growth factor 1 synergistically promote the development of lung adenocarcinoma in mice［J］. Int J Cancer, 2013, 133(10): 2473-2482.

［13］ SIEGFRIED J M, HERSHBERGER P A, STABILE L P. Estrogen receptor signaling in lung cancer［J］. Semin Oncol, 2009, 36(6): 524-531.

［14］ MOHIT K V, YASUHIRO M, KEIKO A, et al. Co-expression of estrogen receptor beta and aromatase in Japanese lung cancer patients: gender-dependent clinical outcome［J］. Life Sci, 2012, 91(15-16): 800-808.

［15］ LI L, WANG H, DU J, et al. Expressions and clinicopathological characteristics of ertrogen receptor α,βand epidermal growth factor in non-small cell lung cancer［J］. Modern Oncol, 2013, 21(3): 539-543.

［16］ NAVARATNAM S, SKLIRIS G, QING G, et al. Differential role of estrogen receptor beta in early versus metastatic nonsmall cell lung cancer［J］. Horm Cancer, 2012, 3: 93-100.［17］ WU C, CHANG Y, SHIH J, et al. The significance of estrogen receptor beta in 301 surgically treated non-small cell lung cancers［J］. J Thorac Cardiovasc Surg, 2005, 130(4): 979-986.

欢迎订阅2013年《循证医学》杂志

《循证医学》是经国家新闻出版署批准，广东省卫生厅主管，由广东省循证医学科研中心、广东省人民医院和中山大学附属第三医院主办的医学学术期刊。现为“中国科技论文统计源期刊（中国科技核心期刊）”，《CNKI中国期刊全文数据库》、“万方数据 — 数字化期刊群”全文收录期刊，“中国学术期刊综合评价数据库”统计源期刊，《中国科学引文数据库》、《中国生物医学文献数据库》、《中国核心期刊（遴选）数据库》、《中文生物医学期刊文献数据库》、《中文科技期刊数据库》来源期刊，荣获首届《CAJ-CD规范》执行优秀期刊奖。

主编吴一龙（广东省人民医院副院长、广东省人民医院肿瘤中心主任、广东省肺癌研究所所长、广东省循证医学科研中心主任，中山大学、南方医科大学、汕头大学、广东省心血管病研究所肿瘤学教授，博士生导师）。本刊以广大医药卫生技术人员和医疗、教学、科研管理工作者为读者对象，立足临床医学，介绍循证医学（evidence-based medicine , EBM）的理念、方法及相关知识，探讨符合中国国情的循证医学实践，促进国内外医学学术交流和医学科学发展。

本刊以临床实践指导性为特色，设置的主要栏目有：先睹为快、述评、特别报告、循证评价、论著（包括诊断性研究、疗效研究、病因学研究、疾病的预后研究等）、证据的寻求与评价、循证医学中的医学统计学问题、循证医学理论与方法研究、综述与讲座、教育与争鸣、循证医学在线、循证病例讨论、临床指引与共识等。诚挚欢迎投稿。

《循证医学》杂志的国际标准刊号：ISSN 1671-5144, 国内统一刊号：CN 44-1548，双月刊、大16开本、64页，国内定价每期10元，全年60元。欲订阅者请从全国各地邮局订购，邮发代号 46-326，也可直接从本刊编辑部邮购。欢迎新老朋友订阅本刊。

地址：广州市中山二路106号广东省人民医院《循证医学》编辑部（510080）。

电话：020-83844620，020-83827812-51482；

传真：020-83844620

网址：www.jebm.cn

E-mail: xzyxzz@163.net

《循证医学编辑部》

Relationships between survival and expressions of estrogen receptor α and β in non-smoking nonsmall cell lung cancer patients

JIAN Hong1, ZHU Lei2, SHAO Jin-chen2, ZHAO Yi1, LI Chuan-jia1, YU Yong-feng1, ZHANG Jie2(1.Shanghai Lung Tumor Clinical Medical Center, Shanghai Chest Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China; 2.Department of Pathology, Shanghai Chest Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200030, China)

ZHANG Jie E-mail: jiezhang49@hotmail.com

Background and purpose: The involvement of estrogen signaling in lung cancer is controversial. But the findings showed that ERβ might play an important role in neoplastic lung biology. Several studies have evaluated expression of ERβ in both normal and neoplastic human lung tissues with variable conclusions. We aimed to evaluate the expressive of estrogen receptors (ER) α, β in non-smoking non-small cell lung cancer (NSCLC) and investigate the relationships between the survival and expressions of ERα, β. Methods: Immunohistochemical assay was used to detect the expression ERα and ERβ in 144 NSCLC patients, and analyzed the expressions status of ERα, β and survival. Results: The positive rate of ERα was 7.6%, only in adenocarcinoma cancer. The positive rate of ERβwas 52.1%, and the expressions of stage Ⅰ and Ⅱ was significantly higher than that of stage Ⅲ and Ⅳ (P=0.020). The median survival time (MST) of ERβ positive expression was better than that of negative expression (43 months vs 38 months, P=0.028). The MST of ERβ positive expression of female patients was better than that of negative expression (45 months vs 37 months, P=0.033). The MST of ERβ positive expression of adenocarcinoma were 46 months and better than negative 38 months (P=0.021). Conclusion: The expression of ERβ was significantly higher in early-stage non-smoking NSCLC. It indicated that the positive expression of ERβ was related to the better MST, especially in female adenocarcinoma patients.

Non-smoking; NSCLC; Estrogen receptor

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.11.010

R734.2

：A

：1007-3639(2013)11-0910-07

2013-08-10

2013-10-15）

上海市卫生局课题(No：2008127)。

张杰 E-mail:jiezhang49@hotmail.com