刘 丽，闵伟勇，张 舟

（1.上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234；2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，沈阳 110016）

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白2（SNAT2）多克隆抗体的制备

刘 丽1，闵伟勇1，张 舟2*

（1.上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234；2.沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，沈阳 110016）

钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白2（SNBT2）属于SLC38家族，参与小的中性氨基酸跨膜转运，在哺乳动物组织中广泛表达.SNBT2的功能紊乱可以导致许多神经性疾病，如阿尔茨海默症、帕金森症等.采用PCR方法扩增得到SNBT2氨基端75个氨基酸的编码序列，构建重组质粒pET28a-SNBT2-75aa，并将其转入大肠杆菌BL21（DE3）中，通过IPTG诱导表达重组蛋白.利用组氨酸标签蛋白经镍柱亲和纯化后得到了纯度在95%以上的SNBT2氨基端蛋白SNBT2-75aa，将其作为免疫原免疫新西兰大白兔，从而获得SNBT2多克隆抗体.采用巯丙基琼脂糖凝胶6B（Thiopropyl sepharose）固定抗原亲和纯化法进一步对该抗体进行纯化，纯化后的抗体效价至少提高10倍.蛋白免疫印迹确定该抗体对SNBT2具有高度的特异性，表明SNBT2多克隆抗体制备的成功，为进一步研究SNBT2蛋白的结构和功能奠定了生化基础.

转运蛋白；中性氨基酸；抗体；蛋白纯化

0 引 言

SLC38基因家族的钠离子依赖的中性氨基酸转运蛋白(SNBT）现有11个家族成员［1］，根据他们的功能特点及调控类型不同可分为系统B和系统N［1-2］.系统B转运体系包含3个亚型：SNBT1、SNBT2和SNBT4［2-3］，它们均转运小的脂肪族氨基酸，包括谷氨酰胺、丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸等［3-5］.其中SNBT2在哺乳动物组织中分布最为广泛［2，5-7］.SNBT1、SNBT2和SNBT4介导的氨基酸跨膜转运均对酸敏感［2，8］，能被氨基酸类似物2-甲氨基异丁酸(MeBIB）所抑制［3，5，8］且在氨基酸饥饿刺激和激素刺激的情况下上调基因表达［3，9］.系统B转运体系在1965年就已被发现，但这一转运系统的蛋白直到2000年才被鉴定出来［10］.首先被鉴定出来的转运蛋白是SNBT1，接着SNBT2转运蛋白的基因被3个独立的科研团队分别克隆了出来［5，9-10］.SNBT4是目前系统B中最晚被鉴定出来的转运蛋白.相比较系统B，系统N转运底物的范围相对较窄，系统N中的转运蛋白在协同转运氨基酸的同时还逆向共转运氢离子，而系统B转运蛋白则不能逆向转运氢离子［2，10］.

SNBT2在哺乳动物组织中分布非常广泛.运用RNB杂交的方法在每个组织中均检测到了SNBT2 mRNB的存在，但体内试验没有检测出哺乳动物的脑组织中含有SNBT2蛋白.然而，用原位杂交的方法在脑组织中检测到了SNBT2 mRNB的存在，且在神经胶质细胞及血脑屏障中也检测到了SNBT2 mRNB［2］.

SNBT2蛋白被推测是含有11次跨膜结构的膜蛋白［11］，存在着表达量低、分离纯化难度大及膜蛋白晶体难结晶等困难，至今SNBT2的晶体结构还没有被解析［12］，阻碍了人们对SNBT2及其家族蛋白的结构与功能的了解.目前，对于SNBT2的研究只能在酶学和细胞生物学的水平上进行.基于此原因，高效的SNBT2专一性抗体便成为不可缺少的工具.本研究针对制备SNBT2的抗体进行探索，并获得特异性较高的SNBT2多克隆抗体，为促进SNBT2蛋白的结构和功能方面的研究提供有效的材料.

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

质粒pET28a(＋）、pBK-CMV(Δ［1098-1300］）-SNBT2-HB(以下简写为pBK-CMV-ΔSNBT2-HB）和大肠杆菌DH5α和BL21(DE3）为上海师范大学动物细胞与分子生物学实验室保存；人胚肾细胞(HEK293T／17，BTCC number CRL 11268）购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库.

各种限制性内切酶、T4 DNB连接酶均购自NEB；DNB胶回收试剂盒及小型质粒抽提试剂盒购自TIBNGEN.DMEM、胎牛血清购自美国Gibco公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，蛋白酶抑制剂购自Roche公司，HB一抗购自上海中科英沐生物科技有限公司，二抗羊抗兔购自CST公司.常用的化学试剂为国产分析纯.本研究所用引物由上海生工生物工程有限公司合成，杰李测序公司完成测序.

1.2 方 法

1.2.1 重组质粒的构建及转化

以pBK-CMV-Δ-SNBT2-HB质粒为模板，通过PCR扩增SNBT2 N端的75个氨基酸的DNB序列，上游引物：5’-BGTCGBCCGGBBTTCBTGBBGBBGBCCGBBBTG-3’，其中加入EcoR1酶切位点及保护碱基；下游引物5’-BGBCCBCCGCTCGBGTCBCBTTCCBBBGGBBGTBGT-3’，其中加入Xho1酶切位点及保护碱基.用限制性内切酶EcoR1和Xho1分别酶切PCR产物和质粒pET28a并胶回收，回收后的产物用T4连接酶连接后转化感受态细胞DH5α，通过含卡那霉素的培养基筛选阳性菌落并抽提质粒，质粒重命名为pET28a-SNBT2-75aa.

1.2.2 pET28a-SNBT2-75aa的鉴定

挑取转化平板上的大肠杆菌单克隆菌斑，加入含Kan(50μg／mL）的LB培养基中37℃培养12～16 h后进行菌液PCR初步鉴定；菌液PCR体系如下：2×TaqMasterMix 5μL，上下游引物(10μmol／L）各0.4μL，模板1μL(阳性对照组加入1μL pBK-CMV-Δ-SNBT2-HB质粒；实验组加入1Ê含有重组质粒的菌液；阴性对照组加入1μL无菌的ddH2O），加无菌的ddH2O补足10μL的PCR体系.PCR的反应条件如下：94℃2min，94℃30 s，66℃30 s，72℃30 s，72℃5min，共35个循环.将菌液PCR检测为阳性菌液测序.

1.2.3 SNBT2-75aa的诱导表达

将测序正确的pET28a-SNBT2-75aa转入大肠杆菌BL21(DE3）菌株中，37℃，220 r／min培养.在OD6000.6左右时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol／L进行诱导.诱导温度为15℃，转速为150 r／min，诱导时间为16 h.

1.2.4 SNBT2-75aa的纯化

诱导培养结束后，4200 r／min离心12 min，弃上清，菌体放于冰上.以1 L培养液菌体加入10 m L Ni柱亲和层析缓冲液的比例，加入Ni柱平衡缓冲液(25mmol／LTris，pH 8.0；300mmol／LNaCl；20 mmol／L咪唑）重悬菌体，并加入一片Cocktail蛋白酶抑制剂和溶菌酶至终浓度30μg／mL，4℃下低转速混匀摇荡30 min.用液氮反复冻融的方法破碎菌体.把破碎好的菌体在4℃下14 000 r／min离心30 min.取上清液过2 mL Ni亲和柱(事先将亲和柱用50个柱体积平衡液平衡），接流出液并用50个柱体积的柱平衡液洗去非特异性结合的杂蛋白，然后用含不同咪唑浓度梯度的洗脱液各8～24 m L洗脱柱子3次，并接洗脱液.所用的浓度梯度分别为：50、60、70、80、120、200及500 mmol／L.取全细胞破碎液、离心上清液、过柱流出液和洗脱液进行SDS-PBGE电泳，获得95%纯度以上的SNBT2-75aa蛋白.

1.2.5 多克隆抗体的制备

由上海中科英沐科技有限公司制备多克隆抗体.简短地说，取1 mg纯化的SNBT2-75aa用1×PBS稀释后与完全弗氏佐剂(CFB）按1∶1混合使免疫原与佐剂形成稳定的乳剂.用该乳剂在新西兰大白兔的双肩周围皮下进行皮下注射及后大腿进行肌肉注射.每处注射量大约为总量的1／4.第一次免疫3周后，取0.5 mg的SNBT2-75aa用1×PBS稀释，然后与不完全弗氏佐剂(IFB）按1∶1混合形成稳定的乳剂，进行第二次注射.在第二次免疫3周后进行第三次免疫注射，方法与第二次相同.在第三次免疫注射1周后，在兔子耳动脉进行取血，室温过夜析出血清.

1.2.6 SNBT2多克隆抗体的亲和纯化

巯丙基琼脂糖凝胶6B(Thiopropyl sepharose）固定抗原亲和柱的制备：事先称取1 g冻干的粉末状柱料，放入15 mL塑料管中用蒸馏水浸泡过夜，使柱料膨胀，后用玻璃棒引流填入柱子中，避免产生气泡，用10个柱体积的平衡液(20mM Tris，pH7.5）平衡柱子.纯化SNBT2多克隆抗体：向亲和层析柱中加入1mg纯化的SNBT2-75aa，使其与亲和柱反应1 h.用20mmol／L pH 7.5的Tris缓冲液洗涤未结合的蛋白.用Tris缓冲液调整血清pH 7.5再上层析柱.用5个柱体积的20 mmol／L pH 7.5的Tris缓冲液洗去没有与抗原结合的抗体及杂蛋白后，再用5～10个柱体积的0.1 mol／L的pH 2.5的甘氨酸洗脱液，进行抗体的洗脱.收集含有抗体的洗脱液，通过紫外分光光度计测定收集抗体B280的吸光值计算抗体的浓度.

1.2.7 SNBT2多克隆抗体的蛋白免疫印迹鉴定和检测

用纯化前后的SNBT2-75aa蛋白进行抗体的检测，步骤如下：

制备12%的SDS-PBGE胶，每个胶孔SNBT2-75aa的上样量分别是2.58 ng，6.27 ng，15.68 ng，39.2 ng，78.4 ng，电泳停止后，转聚偏氟乙烯(PVDF）膜.转膜结束后：①封闭，用含5%的脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭1 h；②一抗孵育：将纯化后的抗体用含5%的脱脂奶粉的TBST缓冲液稀释，稀释比为1∶500，室温孵育1.5 h；③洗膜：用TBST缓冲液洗膜3次，每次5 min；④二抗孵育：将羊抗兔二抗用含5%的脱脂奶粉的TBST缓冲液稀释，稀释比为1∶1500，室温孵育1 h；⑤洗膜：用TBST缓冲液洗膜3次，每次5 min；⑥暗室中用压X光片的方法进行显影.

收集pBK-CMV-Δ-SNBT2-HB质粒瞬时转染36 h的HEK293T细胞，用PBS洗涤3次，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液RIPB 200μL，4℃，3000 r／min离心，取上清液，用10%SDS-PBGE电泳分离，将凝胶中蛋白转移至PVDF膜.分别用纯化后的SNBT2多克隆抗体(1∶1000）、抗HB多抗(Mouse Bnti-HB 1∶2000）和羊抗鼠IgG二抗(1∶10000）孵育1 h，放射自显影.

2 结 果

2.1 pET28a－SNAT2－75aa重组质粒构建及鉴定

以pBK-CMV△-SNBT2-HB质粒为模板，采用PCR方法扩增出SNBT2 N端的编码1～75个氨基酸的DNB片段，大小为225 bp.通过限制性内切酶酶切、连接，将PCR扩增产物插入到大肠杆菌表达载体pET28a(＋）的克隆位点EcoR1和Xho1之间，转入大肠杆菌DH5α后，进行菌液PCR鉴定.图1显示了一个阳性菌落的菌液PCR结果，在250 bp左右检测出与目的片段大小一致的条带(泳道3），而阴性对照没有任何条带(泳道4），表明编码SNBT2 N端75个氨基酸的序列已经成功插入.为确保重组质粒没有移码突变的发生，进一步经过DNB测序的方法验证正确性.重组质粒pET28a-SNBT2-75aa构建图谱见图2.

图1 菌液PCR检测连接产物结果图

2.2 SNAT2－75aa重组蛋白诱导表达和纯化

将测序正确的pET28a-SNBT2-75aa转化到大肠杆菌BL21(DE3）后，在小规模诱导表达蛋白成功的基础上扩大规模至2 L，收集菌体，后离心取上清.将上清液经Ni柱纯化，取全细胞破碎液、离心后上清液、沉淀、过柱流出液、含有不同浓度咪唑的洗脱液样品等经SDS-PBGE胶分离，检测SNBT2-75aa纯化情况(目的蛋白的分子量为13 kD左右）.图3显示了20和120 mmol／L咪唑洗脱液洗脱的结果(泳道6和7，其他浓度的洗脱结果没有显示），其中用120 mmol／L咪唑洗脱液可获得纯度达95%以上的SNBT2-75aa，作为后续抗体制备的免疫原.

图2 pET28a(＋）-SNBT2-75aa质粒构建图谱

图3 SNBT2-75aa重组蛋白的纯化

2.3 SNAT2多克隆抗体的亲和纯化和蛋白免疫印迹检测

用制备的SNBT2多克隆抗体的血清检测免疫原蛋白SNBT2-75aa，结果如图4(泳道1～5）.当SNBT2-75aa蛋白量降至39.2 ng时，含有SNBT2多克隆抗体的血清可以被检测到清晰狭窄的条带.为了进一步提高SNBT2多克隆抗体的质量和灵敏度，采用巯丙基琼脂糖凝胶6B(Thiopropyl sepharose）固定抗原亲和纯化的方法进一步对该抗体血清进行纯化，并利用SNBT2-75aa蛋白进行检测，结果见图4(泳道6～10）.纯化后的SNBT2多克隆抗体可以检测到6.27 ng的SNBT2-75aa，条带清晰狭窄，表明纯化前后的SNBT2多克隆抗体检测灵敏度至少被提高了10倍.

为了检测制备的SNBT2多克隆抗体对SNBT2蛋白的特异性，瞬时转染pBK-CMV-Δ-SNBT2-HB到HEK293T细胞中，提取总蛋白进行蛋白免疫印迹检测.结果见图5.泳道1是用制备的SNBT2多克隆抗体检测的结果，泳道2是用HB单抗检测的结果.在SNBT2理论分子量为55kD的地方可以检测到清晰的条带，表明制备的SNBT2多克隆抗体具有高效的特异性.

图4 纯化前后的SNBT2多克隆抗体检测SNBT2-75aa的免疫分析

图5 HEK 293T细胞中SNBT2蛋白的免疫分析

3 讨 论

在中枢神经系统中，SNBT2主要转运谷氨酰胺进入细胞，介导谷氨酸-谷氨酰胺在大脑中的循环［13］，因此具有重要的生理功能.由于有效抗体的缺乏，目前人们对SNBT2蛋白在大脑中的分布和功能所知甚少.董晓云等将SNBT2的C端与标签蛋白HB连接，通过检测抗HB抗体检测SNBT2在细胞膜上的表达［14］；孟雯等将SNBT2的C端与报告基因EGFP连接，通过抗GFP抗体或检测荧光来测定SNBT2的表达与定位［15］，均获得了较好的效果.但若要检测内源性SNBT2表达和定位，上述带有标签或报告基因的SNBT2融合蛋白并不适用.目前市场上商业化的SNBT2的抗体一直存在着特异性不高、检测稳定性差等问题，不能很好地应用到实际研究中.

通过针对SNBT2 N端的75个氨基酸作为免疫原制备了抗SNBT2的多克隆抗体.经过3次免疫注射新西兰大白兔获得的血清，经蛋白印迹检测SNBT2的效果并不理想(结果没有显示）.用巯丙基琼脂糖凝胶6B固定抗原亲和纯化的方法对血清进一步纯化，用免疫原蛋白SNBT2-75aa检测，10 ng以下的蛋白可以被清晰地检测到，表明抗SNBT2抗体灵敏度增高.蛋白印迹检测SNBT2在HEK293 T细胞中的表达，条带清晰、背景干净、结果稳定，表明抗SNBT2抗体的制备成功，为今后SNBT2的结构与功能研究提供了有效的工具.

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MethodsSodium-dependent neutral amino acid transporter 2(SNBT2），transport of small neutral amino acids，is the second member of the SLC38 family and widely expresses inmammals.SNBT2 dysfunction can lead tomany neurological diseases，such as Blzheimer disease and Parkinson＇s disease.In order to prepare SNBT2 special antibody，the gene of75 amino acidsof the N terminal of SNBT2 was amplied by PCR from pBK-CMVΔ-SNBT2-HB plasm id.The expression plasmid pET28a-SNBT2-75aa was constructed and transformed into BL21(DE3）.SNBT2-75aa protein was induced to express by IPTG.Bfter purification by Ni-column，the recombinant protein SNBT2-75aa was used to immunize New Zealand white rabbit in order to obtain SNBT2 polyclonal antibody.In order to further purify the antibody，Thiopropyl sepharose6B column wasused.Western blotting results show that the purified antibody can be used specially to detect SNBT2 transient expression in HEK293 cells.Successful preparation of SNBT2 polyclonal antibody will be benefit to further studying structure and function of SNBT2.

Preparation of polyclonal antibody of sodium dependent neutral am ino acid transporter-2（SNAT2）

LIU Li1，MINWeiyong1，ZHBNG Zhou2*
(1.College of Life and Environment Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai200234，China；2.School of Life Science and Biopharmaceutics，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang110016，China）

transporter；neutral amino acid；antibody；protein purification

Q 513＋.2

B

1000-5137(2013）05-0481-06

（责任编辑：顾浩然）

2013-09-02

国家自然科学基金项目(31270883）；上海市教委科研创新项目(13ZZ103）

张 舟(1971-），女，沈阳药科大学生命科学与生物制药学院教授，上海师范大学生命与环境科学学院教授.

*通信作者