苗 兰曹 进徐 立孙明谦刘建勋

（1中国中医科学院西苑医院基础医学研究所，中药药理北京市重点实验室，北京，100091；2中国食品药品检定研究院，北京，100050）

维脑康干预大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的蛋白质组学研究

苗 兰1曹 进2徐 立1孙明谦1刘建勋1

（1中国中医科学院西苑医院基础医学研究所，中药药理北京市重点实验室，北京，100091；2中国食品药品检定研究院，北京，100050）

目的：应用LC-MS／MS蛋白质组学方法研究维脑康胶囊治疗大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的作用机制。方法：大鼠分为正常对照组、模型对照组及维脑康胶囊组，取大鼠全血离心获得血清，进行酶解，应用nano Chip-ESIIon Trap进行样本分析，测定结果利用Agilent Spectralmill、scaffold及SIMCA P+等软件进行蛋白鉴定、模式判别及蛋白相对定量分析。结果：最终比对出正常对照组、模型对照组和维脑康胶囊组的总蛋白数分别为833个、701个和798个，与正常对照组相比，模型对照组分析出的差异蛋白共18个，其中上调的是13个蛋白，下调的是5个蛋白，而在维脑康胶囊组中这些差异蛋白的表达均有所恢复，其功能分别与神经元凋亡、神经元生长与分化、信号通路及转录调控等过程密切相关。结论：维脑康胶囊治疗局灶性脑缺血再灌注的作用机制可能与这些差异蛋白有关，为维脑康胶囊作用的分子机制研究提供了新思路。

维脑康；蛋白质组学；局灶性脑缺血再灌注

脑血管病是导致人类死亡的三大疾病之一，在全球范围内，每年使460万人死亡，中国也是脑卒中高发地区，据估计居民现患脑血管病600万，每年新发生脑血管病130万人，死亡近100万人，因此，如何有效治疗脑血管病已成为目前关注的热点。中药制剂在治疗脑血管病方面具有独特的优势，维脑康胶囊（WNK）系由人参、银杏叶等中药组成的中药复方，临床研究表明，该药对血管性痴呆（VaD）患者有明显的改善作用［1］。前期的实验研究表明WNK对化学损伤造成的小鼠获得性、巩固性及再现性记忆障碍均有改善作用［2］，可能通过下调过量的氨基酸释放而起到脑保护作用［3］。但是，WNK的作用机制、具体的作用靶点尚不清楚。从蛋白质组学角度对中药的多环节、多靶点调控作用进行研究，可从整体水平揭示中药单方、复方的作用机制，阐明药物作用的物质基础。

本研究中，我们通过对正常、局灶性脑缺血再灌注模型大鼠及给予WNK治疗大鼠进行血清蛋白质提取、分离、鉴定及数据比对，从整体上研究经WNK治疗的局灶性脑缺血再灌注模型大鼠特有蛋白质的表达情况，可望从分子水平上探讨WNK治疗局灶性脑缺血再灌注的作用机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 仪器：Agilent 6340 Ion Trap（Chip -ESI源）；Agilent 1200 nano-LC（Chip），Agilent chemstaion色谱工作站（Agilent，USA）；METTLER TOLEDO AE240电子分析天平；注射泵KDS100CE购自KD Scientific公司；蛋白分析用Chip C18，150mm× 75μm（Agilent，USA）。

试剂：三羟甲基氨基甲烷Tris购自amresco，TCEP、胰蛋白酶Trypsin均购自Thermo，碘代乙酰胺IAA购自sigma公司，乙腈、丙酮分别为fisher、J.T.Braker公司产品，均为色谱纯，甲酸购自J.T.Braker公司，为分析纯，BCA试剂盒购自百泰克公司，实验用水为娃哈哈纯净水。

1.2 方法

1.2.1 动物血清样品的采集 前期采用线栓法建立局灶性脑缺血再灌注大鼠模型，并给予中药WNK进行治疗，之后采集正常对照组、模型组及WNK组大鼠全血，每组各10只。每只大鼠采集2 mL血液，4℃放置30 min后，自然凝固，离心（3500 r／min，15 min）。取上清转移至eppendorf管，离心（7500 r／min，30 min），取上清作为血清样品，放入-80℃低温保存。血清应用Bicinchoninic acid Protein Assays（BCA）法测定蛋白浓度。

1.2.2 样品的处理 取50μL血清与3倍体积50 mmol／L Tris缓冲液混合，涡旋1 min，加入3倍体积-20℃预冷丙酮，涡旋1 min，4℃沉淀过夜，离心8000 r／min，15 min，4℃，取沉淀，使丙酮挥发完全，但不使样品完全干燥，备用。

1.2.3 蛋白质酶解 混悬蛋白于50mM tris buffer pH8.5中，浓度大约1～3 mg／mL；活化Trypsin（50 mM浓度，tris溶液）后，以蛋白含量与胰蛋白酶液比例为20∶1加入酶液，37℃水浴3 h，每1小时涡旋1次，此为第一次消解；加入1 mM TCEP，37℃水浴30 min，放冷至室温；进行烷基化，3μL IAA溶液对应10μg蛋白，37℃水浴20 min（避光）；第二次消解，以蛋白含量与酶液比例为30∶1加入酶液，37℃水浴过夜；终止反应，每50μL溶液加入2μL甲酸；离心，12000 r／min，4℃15 min，取上清液分析。

1.2.4 质谱及色谱条件 质谱条件：Scan Mode：Ultra Scan；Source：ESI-Chip；阳离子模式；Capillary：-1900V；Dry temp：300oC；Dry Gas：3.0 L／min；Skimmer：30V；Cap Exit：100V；Trap Drive：80.0；Smart Target：500000；Accu Time：200ms；MS／MS Frag Amp：l.0V；质量范围：300～2000m／z，离子排除：5个前体离子；排除时间30s。

色谱条件：Chip：150mm 300A C18chip w／160nL trap column；进样量：0.2μL；Pump1（nano pump）流动相：A相为97%水和3%乙腈溶液加甲酸至0.1%，B相为90%乙腈和10%水加甲酸至0.1%；流速：0.3 μL／min；线性梯度洗脱时间程序如下：起始3%B 0-70 min线性上升到45%，70-85 min线性上升到90%，85-95.01 min线性上升到100%，保持15 min，110-115 min下降至3%，持续10 min；运行时间：125 min。Pump2（Capillary pump）流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为90%乙腈和10%水加甲酸至0.1%；流速：3μL／min；线性梯度洗脱时间程序如下：起始0%B持续4 min；4-5 min线性上升到80%，持续5 min，10.01-85 min维持80%，流速为0μL／min，第85.01-95 min线性上升到100%，流速恢复至3μL／min，96 min降至0%；运行时间：125 min。

1.2.5 MS／MS数据搜索 应用Agilent chemstaion色谱工作站中DataAnalysis软件进行图谱分析；应用Excel2007及SPSS 12.0进行数据的统计学分析。

MS／MS数据分析应用的是Agilent Spectrum Mill软件。参数设置：Database：Swissprot；Species：Rattus norvegicus；Digest：Trypsin；Maximum Missed cleavages：2；Fixed Modification：Carbamidomethylation（C）；Precursormass tolerance：+／-2.5Da；Productmass tolerance：+／-0.7；Filter peptides by Score＞6，SPI（scored peak intensity）＞50%；Filter by protein score＞11。

1.2.6 蛋白相对定量和功能聚类 应用scaffold3.0软件进行蛋白数据处理、相对定量、蛋白定位和功能的聚类分析。肽段的鉴定要求其可能性在95%以上视为可信，而蛋白的鉴定要求其可能性在99%以上，同时匹配上的肽段必须有2个以上，假阳性率＜0.01%。相对定量的方法是采用累计谱图计数的方法，即用鉴定的MS／MS谱图总数来评价一个特定蛋白的丰度，对不同分组中的这个蛋白所检测到的MS／MS谱图总数进行归一化后，再进行相对丰度的比较。在scaffold软件中支持多组数据同时处理与统计学计算，本课题分为正常对照组、模型组和WNK组，共3组，因此统计学方法用的是适用于多组比较的ANOVA Test方法，P＜0.05。在上述参数设置及数据分析方法的前提下，再应用scaffold3.0软件中GO注释的功能进行蛋白质功能聚类分析。

2 结果

2.1 大鼠血清整体蛋白的发现 通过应用非标记液相色谱／质谱联用技术进行WNK治疗局灶性脑缺血再灌注大鼠作用机制的血清蛋白组研究，分别设立为正常对照组、模型组和WNK组，结合Spectrum Mill和scaffold软件的搜索比对和分析，最终比对出正常、模型和WNK组的总蛋白数分别为833个，701个，798个。

图1 大鼠血清蛋白组三维PCA图

图2 大鼠血清蛋白组OPLS-DA图

2.2 大鼠血清蛋白组主成分和偏最小二乘法分析应用SIMCA P+12.0软件进行蛋白组数据的模式判别和预测，针对不同的分组进行区别。研究中利用最终搜索出的蛋白进行比较，以获得的正常对照组特异性蛋白为参照，对3组来源样品进行了PCA和OPLSDA分析，将上述各组进行分类，各组聚类较好。如图，在PCA图和OPLS-DA图中，结果可看出3组样品呈现三角形分布，且各自聚类较显著，彼此之间能够得到较好的区分。

2.3 检出蛋白功能总结 本研究应用scaffold3.0中GO注释的功能，针对检测到的蛋白进行了蛋白功能和蛋白定位的聚类分析。如下图，检测到的蛋白所涉及的生物学过程包括：应激反应、多细胞生物过程、代谢过程、定位、免疫系统过程、生物调控反应、发育过程、细胞过程等一系列生物学过程。而蛋白的定位大部分分布于细胞膜、线粒体、细胞器膜、胞质、细胞骨架、细胞内细胞器及细胞外区域等。而如图4，检测到的蛋白功能主要涉及分子功能、结合功能、分子信号转导活性、酶调控活性及催化活性等。

图3 大鼠血清检出蛋白所涉及的生物学过程

图4 大鼠血清蛋白组检出蛋白的功能分类

图5 经定量比较后的差异蛋白

2.4 差异蛋白及其功能分析 对于所检测出的蛋白利用累积计数的方式，并应用Scaffold软件进行了蛋白相对量的比较，蛋白改变在2倍以上视为差异蛋白（图5）。分析出的差异蛋白共18个（表1、2），其中与正常对照组比较，模型组中上调的是13个蛋白，下调的是5个蛋白，而在WNK组中这些差异蛋白的表达有所恢复，说明药物可能通过调控这些蛋白而起到了一定的治疗作用。同时这些差异蛋白其功能特性分别与神经元凋亡、神经元生长与分化、信号通路及转录调控等过程密切相关。3 讨论

序号ID 0.2 Tripartitemotif-containing protein 8 2 P29621 46766.3 7.69 Musmusculus SwissProt 22.52 Serine protease inhibitor A3C 3 A2CE44 90376.9 7.75 Musmusculus SwissProt 19.16 Zinc finger X-linked protein 4 Q921 I1 76724.3 6.94 Musmusculus SwissProt 28.92 Serotransferrin 5 Q99246 240139.8 6.45 Musmusculus SwissProt 26.37 Voltage-dependent L-type calcium channel subunit alpha-1D 6 Q9D9I4 45825.3 6.47 Musmusculus SwissProt 8.4 TBC1 domain familymember20 7 Q80YR4 99192.6 8.7 Musmusculus SwissProt 13.61 Zinc finger protein 598 8 Q6DID5 76069.5 8.75 Musmusculus SwissProt 9.23 PWWP domain-containing protein MUM1 9 Q8BGT6 94091.8 6.26 Musmusculus SwissProt 18.81 MICAL-like protein 1 10 Q8BKC8 91515.6 5.91 Musmusculus SwissProt 13.4 Phosphatidylinositol4-kinase beta 11 P11087 138033.1 5.65 Musmusculus SwissProt 31.6 Collagen alpha-1（I）chain 12 P25446 37418.1 8.42 Musmusculus SwissProt 15.34 Tumor necrosis factor receptor superfamilymember 6 13 P26618 122684 5.03 Musmusculus SwissProt 17.32 Alpha-type platelet-derived growth factor receptor 14 Q2TPA8 54208.7 6.31 Musmusculus SwissProt 11.54 Hydroxysteroid dehydrogenase-like protein 2 15 Q4VAC9 148572.8 5.5 Musmusculus SwissProt 23.74 Pleckstrin homology domain-containing family G member 3 16 P97792 39947.8 6.54 Musmusculus SwissProt 8.52 Coxsackievirus and adenovirus receptor homolog 17 Q8BSI6 65751.9 5.3 Musmusculus SwissProt 10.56 R3H and coiled-coil domain-containing protein 1 18 Q8VEG6 63023.7 6.1 Musmusculus SwissProt 14.63 CCR4-NOT transcription complex subunit分子量等电点种属数据库分值蛋白名称1 Q99PJ2 61605.4 7.26 Musmusculus SwissProt 1 6-like

功能1 Tripartitemotif-containing protein 8序号蛋白名称蛋白结合酶2 Serine protease inhibitor A3C丝氨酸型蛋白内切酶抑制剂3 Zinc finger X-linked protein正向调节核酸结合转录因子活性4 Serotransferrin细胞内铁离子转运，调节铁离子平衡5 Voltage-dependent L-type calcium channel subunit alpha-1D G蛋白信号转导，离子转运6 TBC1 domain familymember 20细胞膜Rab GTP酶活性调节7 Zinc finger protein 598结合金属离子蛋白8 PWWP domain-containing protein MUM1 DNA修复9 MICAL-like protein 1细胞骨架10 Phosphatidylinositol4-kinase beta高尔基体组成，核苷酸结合转移酶活性11 Collagen alpha-1（I）chain成骨细胞分化，胶原蛋白合成，蛋白传输相关12 Tumor necrosis factor receptor superfamilymember 6肿瘤坏死因子，激活T细胞凋亡13 Alpha-type platelet-derived growth factor receptor血小板生长因子，正向调节成纤维细胞增值14 Hydroxysteroid dehydrogenase-like protein 2代谢过程相关15 Pleckstrin homology domain-containing family Gmember 3 Rho蛋白信号转导调控16 Coxsackievirus and adenovirus receptor homolog反相调节心肌细胞增值17 R3H and coiled-coil domain-containing protein 1核酸结合受体活性相关18 CCR4-NOT transcription complex subunit6-like mRNA过程

本文应用液质联用的蛋白质组学方法，在对WNK治疗大鼠局灶性脑缺血再灌注的作用机制进行初步研究中，发现多种蛋白发生了明显的变化，包括神经元凋亡相关蛋白、神经元生长与分化调控蛋白、炎症相关蛋白等。

丝氨酸蛋白酶（serine proteases）是一个蛋白超家族，主要通过切割蛋白序列中精氨酸位点来发挥蛋白水解活性，目前研究的这类蛋白主要与凝血和溶栓功能有关［4］。除了在血液系统中存在，还有定位在中枢神经系统中的丝氨酸蛋白酶，现在研究较多的就是纤溶酶原激活剂（t-PA），尿激酶型纤溶酶原激活剂（u -PA）及凝血酶（thrombin）。它们在保持中枢神经系统内稳态的过程中起着关键作用。在生物系统中，丝氨酸蛋白酶的活性依赖于与其抑制剂的动态平衡，这些抑制剂充当着目标蛋白酶的假底物，与其催化位点形成紧密结合，通过减缓细胞外蛋白水解，来改变细胞外基质蛋白水解的过程，包括神经元迁移、成熟的突触连接的形成等［5］。神经元性丝氨酸蛋白酶抑制剂（neuroserpin）在建立正常神经元连接体系中起着重要的作用，它能够促进轴突和树突的生长［6］。在脑缺血发生后，体内neuroserpin表达量上调可对大脑神经元及缺血损伤区形成保护作用。neuroserpin表达缺失的局灶性脑缺血中风模型大鼠脑梗死面积及脑损伤程度随着neuroserpin的缺失越来越严重，t-PA活性不断增加，能够引起神经元兴奋性中毒，血脑屏障的破坏，同时诱导小神经胶质细胞活性不断增强，它们又共同促进了前炎症反应的发生和加重；小神经胶质细胞通过对过氧化物、一氧化氮、TNF-α、谷氨酸盐及金属蛋白酶的释放实现神经毒作用和血脑屏障的破坏，而t-PA又进一步促进了这些毒性作用的发生［7］。老年性痴呆（AD）患者脑内Aβ的异常沉积是神经元变性、丢失的重要原因。Aβ在凝集过程中可通过激活小胶质细胞和补体，释放细胞因子和自由基等，诱发炎症反应，促使tau蛋白异常磷酸化，导致神经元凋亡和坏死［8］，而有研究表明neuroserpin通过与Aβ相互作用，形成复合体，从而使Aβ变成非毒性的低聚物，因而实现了神经元保护作用［9］。

同源的Tumor necrosis factor receptor superfamily（TNFRSF）成员与TNF超家族结合可介导多种生物学功能。大部分TNFRSF成员及其TNFSF配基在大脑或神经系统的不同生理阶段都有表达［10］。其在大脑中的表达是否保持平衡状态对于多种神经功能是非常重要的，包括促进神经生长、分化、神经支配、促进感受性及树突形成等［11-12］。一旦TNFSF／TNFRSF的功能或表达发生异常，在免疫反应缺失情况下，就会改变大脑的发展、功能及行为，表现为异常［13］。神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞的TNFSF／TNFRSF表达有所改变就会诱导细胞成熟、细胞寿命、形态学和功能发生变化，从而导致神经系统功能的改变［14］。伴随着神经系统功能的改变，炎症过程如神经炎性和免疫抑制又会进一步促使TNFSF／TNFRSF的表达上调，活性改变［15］。

Zinc finger X-linked protein（ZFX）是具有高度保守序列的锌指转录因子，ZFX整个蛋白都编码在X染色体上，包括酸性转录激活区，核定位序列及具有锌指结构的DNA结合区域［16］。它是胚胎期和成熟期造血干细胞自我更新的转录调控因子，调控人类胚胎干细胞自我更新和分化达到一个平衡状态［16］，有研究报道它与人类的神经胶质瘤、喉鳞状细胞癌、前列腺癌及胃癌疾病过程中的细胞凋亡、细胞增殖及细胞周期有密切的关系，它可以影响AKT的激活［17-18］。在胃癌细胞系中他的表达明显增加，进行基因敲除后可诱导细胞凋亡，增加Bax的表达，同时降低Bcl-2的表达；阻止细胞周期的进行，抑制细胞增殖，其机理是通过下调ERK-MAPK通路来实现的［19］。

本研究中，大鼠局灶性脑缺血再灌注模型组血清的蛋白表达轮廓与正常对照组相比，鉴定出Tripartite motif-containing protein 8、Serine protease inhibitor、Tumor necrosis factor receptor superfamily member等差异蛋白，而给予WNK治疗后，这些差异蛋白呈现与模型组相反的变化趋势，其表达情况与正常对照组较为接近。同时这些差异蛋白的功能特性分别与神经元凋亡、神经元生长与分化、信号通路及转录调控等过程密切相关，这与局灶性脑缺血再灌注发生、发展所涉及的病理过程相吻合，也与前期研究结果显示的WNK具有改善认知、脑保护等药理作用的实验结果较吻合。因此，这些差异蛋白可能是WNK治疗大鼠局灶性脑缺血再灌注作用的分子机制。本研究为我们今后进行深入研究提供了更多的信息和可能性，奠定了良好的工作基础。

［12］Czeschik JC，Hagenacker T，Schäfers M，et al.TNF-alpha differentially modulates ion channels of nociceptive neurons［J］.Neurosci Lett，2008，434（3）：293-298..

［13］Zuliani C，Kleber S，Klussmann S，et al.Controlofneuronal branching by the death receptor CD95（Fas／Apo-1）［J］.Cell Death Differ，2006，13（1）：31-40..

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（2013-09-12收稿）

Proteom ics Study of the Therapeutic Effect of W einaokang on Rats Undergoing Focal Cerebral Ischem ia-Reperfusion Injury

Miao Lan1，Cao Jin2，Xu Li1，Sun Mingqian1，Liu Jianxun1
（1 Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing key Laboratory of pharmacology of Chinesemateriamedica，Beijing 100091，China；2 Traditional Chinese Medicine Pharmacology，Beijing Key Laboratory，Beijing 100091，China；3 National Institute of Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

Objective：To investigate themoleculemechanism ofWeinaokang in treatmentof the ratswith focal cerebral ischemia reperfusion by using LC-MSMSmethod.Methods：Global proteomics analysis had been conducted on serum samples collected from normal group，model group，and Weinaokang treatment group.After digestion，the sampleswere detected by applying nano Chip-ESI Ion Trap. Protein identification，pattern discrimination and relative quantitative analysiswere determined using Agilent Spectralm ill、scaffold 3 and SIMCA P+software.Results：833，701and 798 proteinswere found on healthy group，modelgroup，and TCM treatmentgroup respectively.Compared with healthy group，18 changed proteins had been determined：13 proteins up-regulated，5 proteins down-regulated in model group，and these differential proteins had converse tendency in TCM treatment group.Current studies also aim at themajor functional classification of proteins betweenmodel and health groups，aswell asmodel and treatmentgroups.The biological function of these changed proteins were closely related to growth and differentiation of neurons，neuronal apoptosis，signal transduction and regulation of translation，etc.Conclusion：Themoleculemechanism ofWeinaokang capsule for treating focal cerebral ischemia reperfusionmay be associated with different proteins，and itwill provide a new idea for study ofmoleculemechanism ofWeinaokang capsule.

Weinaokang；Proteomics；Focal cerebral ischemia reperfusion

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.10.003

科技部十二五重大新药创制课题（编号：2012ZX09301002-004）；科技部国际合作项目（编号：2011DFA31440）；北京市“十病十药”研发（编号：Z121102001112006）

刘建勋，男，研究员，博士生导师，主要从事心脑血管药理学研究，Tel：010-62835601，E-mail：liujx0324＠sina.com