王显红 张博 尹时华

不同日龄乳鼠耳蜗外毛细胞底部Prestin蛋白的分布

王显红1张博1尹时华2

目的探讨不同日龄乳鼠耳蜗外毛细胞（OHC）底部Prestin蛋白的分布。方法 分别取3、7、10日龄的Wistar乳鼠单离的耳蜗OHC，利用Prestin特异性抗体染色，在荧光显微镜下观察Prestin蛋白在单离OHC底部细胞膜上的表达与分布。结果 3天组乳鼠单离OHC底部细胞膜无Prestin蛋白的阳性染色；7天和10天组乳鼠的OHC底部细胞膜的中央部分可见Prestin蛋白的阳性染色。3、7、10天组中OHC基底膜上Prestin蛋白的光密度值分别为0.001±0.000、0.868±0.033、1.007±0.012，各时间点之间差异有统计学意义（P＜0.05）。结论不同日龄乳鼠OHC基底膜Prestin蛋白的分布存在差异，随月龄增加，Prestin蛋白表达逐渐增强。

耳蜗； 外毛细胞； Prestin蛋白

Prestin作为外毛细胞的运动蛋白，是电运动和耳蜗放大效应的分子基础。近年来关于Prestin蛋白在外毛细胞的表达、定位及其与外毛细胞电运动和耳蜗放大效应之间的关系成为研究的热点。有研究［1～3］采用全基底膜免疫荧光染色的方法在激光共聚焦显微镜下观察发现，Prestin主要分布在外毛细胞的侧膜上，但有关外毛细胞基底部细胞膜是否有Prestin蛋白的表达尚存不同观点。本研究以乳鼠为研究对象，旨在观察不同日龄乳鼠单离外毛细胞基底部细胞膜Prestin蛋白的表达与分布。

1 材料与方法

1.1 实验动物及外毛细胞的分离 选择出生3、7、10天的Wistar乳鼠，每组10只，雌雄不限，迅速断头并取出颞骨，打开听泡置于PBS溶液中，在解剖显微镜下剥去蜗壳，用游丝镊剔除螺旋韧带和螺旋神经节组织后分离出含Corti器的基底膜，移除Reissner氏膜和Tectorial膜，置于浓度为0.25 mg／ml的木瓜蛋白酶中，37℃孵育10～12分钟，轻柔吹打后用加有10%胎牛血清的DMEM液终止消化。悬液经离心后去上清液，加入1 ml培养液在37℃、5%CO2孵箱孵育24 h。每组约能分离出毛细胞30～40个。

1.2 外毛细胞Prestin蛋白染色 经24 h培养后的外毛细胞用4%多聚甲醛固定30 min，PBS浸洗5 min，3次。封闭液（10%山羊血清和1%BSA）封闭30 min，PBS浸洗5 min，3次。1：1 000羊抗Prestin多克隆抗体（Prestin Antibody（C-16）：Sc-22694，Santa Cruz）4℃过夜，室温复温10 min，PBS浸洗5 min，3次。1：64的FITC标记的兔抗羊IgG二抗抗体（BA1110，武汉博士得）在室温下孵育一小时，PBS浸洗5 min，3次。封片后荧光显微镜下观察。阳性染色为绿色荧光，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.3 统计学方法 用Image-Proplus图像分析软件测定外毛细胞基底膜Prestin蛋白的光密度值，实验数据以¯x±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光显微镜观察结果 Prestin抗体标记的外毛细胞细胞侧膜上均有较强的绿色荧光染色（图1a～c）。3天组乳鼠OHC基底部细胞膜（图1a红色箭头所指处）无Prestin蛋白阳性染色；7天和10天组乳鼠OHC基底部细胞膜的中央部分（图b、c红色箭头所指处）可见Prestin蛋白的绿色荧光染色。2.2 OHC基底膜上Prestin蛋白的光密度值测量结果 3、7、10天组中OHC基底膜上Prestin蛋白的光密度值分别为0.001±0.000、0.868±0.033、1.007±0.012。经统计学处理，3天组与7天和10天组OHC基底膜上Prestin蛋白的光密度值差异有统计学意义（P＜0.01）；7天组与10天组OHC基底膜上Prestin蛋白的光密度值差异也有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

哺乳动物耳蜗具有频率选择性和放大效应，这一生理特征被认为与耳蜗OHC电运动有关。当外界声音引发耳蜗内液体波动及基底膜机械振动时，内毛细胞和OHC表面的纤毛束可将这种机械刺激转换为电信号，其中，内毛细胞转导并将声音信息传入大脑，OHC将电信号转化为细胞长度的机械性改变，并反馈给基底膜，进一步增强基底膜的振动，通过正反馈作用使内毛细胞感受的机械刺激被放大［4］。Prestin是一种特异性存在于耳蜗OHC的马达蛋白，是OHC电运动和耳蜗放大效应的分子基础，在耳蜗内毛细胞未发现Prestin表达［1，2，5］。将小鼠的Prestin基因敲除之后，OHC无Prestin表达，胞体缩短，OHC变性，耳蜗敏感性降低［6～8］。

图1 各组乳鼠OHC胞膜prestin蛋白染色图

Belyantseva等［1］采用全基底膜免疫荧光染色的方法研究Prestin蛋白在OHC的定位和表达，用免疫荧光标记Prestin抗体，发现荧光集中在OHC侧膜，而OHC纤毛、底部及胞质等其他部位无荧光标记，提示Prestin蛋白分布在OHC的侧膜上。但近年来有人运用荧光双染及复合染色等方法观察发现，成年大鼠单离OHC除了侧膜有明显的Prestin抗体阳性染色之外，在OHC底部的细胞膜上也有较强的阳性染色，同时在细胞核平面以下的侧膜即侧膜与基底部细胞膜结合处也有阳性染色［9］。

本实验选用不同日龄乳鼠单离外毛细胞，利用Prestin特异性抗体染色，在荧光显微镜下观察Prestin在耳蜗OHC细胞膜上的表达与分布，结果显示，3天组乳鼠单离OHC基底部细胞膜上无Prestin蛋白的阳性染色；7天和10天组乳鼠的OHC基底膜的中央部分观察到了Prestin蛋白的阳性染色，且分布不断增加，说明不同日龄乳鼠OHC基底膜上Prestin蛋白的分布存在差异。

与全基底膜免疫荧光染色显示方法不同的是，本实验采用的是单离耳蜗OHC，显示除侧膜外，在OHC基底部的细胞膜上也有阳性染色，其原因可能是，活体状态下OHC坐于Deiters细胞上，OHC底部被神经末梢与OHC之间的突触所包绕，采用全基底膜免疫荧光染色时，OHC底部因被遮蔽而无法进行Prestin抗体染色［10］，从而出现不同的实验结果。

曾有研究者提出［9，11］，Prestin蛋白的表达可被控制，并且在细胞生命周期中不断更新，在OHC的底部可能存在Prestin蛋白库，合成的Prestin蛋白由底膜向侧膜扩散。从本实验结果来看，这种推测值得商榷。

1 Belyantseva IA，Adler HJ，Curi R，et al.Expression and localization of prestin and the sugar transporter GLUT-5 during development of electromotility in cochlear outer hair cells［J］.J Neurosci，2000，20：116.

2 Zheng J，Long KB，Shen W，et al.Prestine topology：localization of protein epitopes in relation to the plasma membrane［J］. Neuroreport，2001，12：1 929.

3 Zheng J，Du GG，Matsuda K，et al.The C-terminus of prestin influences nonlinear capacitance and plasma membrane targeting［J］.J cell Sci，2005，118：2 987.

4 陈伟，杨仕明.Prestin-外毛细胞运动蛋白［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2007，42：394.

5 Zheng J，Shen W，He DZ，et al.Prestin is the moter protein of cochlear，outer hair cells［J］.Nature，2000，40：149.

6 Brownell WE，Spectre AA，Raphael RM，et al.Micro—and nanomechanics of the cochiear outer hair cell［J］.Annu Rev Biomde Eng，2001，3：169.

7 Liberman MC，Gao J，He Dz，et al.Prestin is required for electromotility of the outer hair cell and for the cochlear amplifier［J］.Nature，2002，419：300.

8 郭运凯，谢鼎华，杨新明.Prestin基因敲除小鼠听力和毛细胞改变的相关性研究［J］.中华耳科学杂志，2004，2：245.

9 于宁，翟所强，赵红波.外毛细胞基底侧膜动力蛋白分布均一性的研究［J］.听力学及言语疾病杂志，2009，17：461.

10 Adler HJ，Belyantseva IA，Merritt RC Jr，et al.Expression of prestin，amembrane motor protein，in the mammalian auditory and vestibular periphery［J］.Hear Res，2003，184：27.

11 Yu N，Zhu ML，Zhao HB.Long—term usage of salicylate upregulates prestin expression in the guinea pig cochlea［J］.Cell Mo1 Life Sci，2008，65：407.

（2013-03-06收稿）

（本文编辑 雷培香）

10.3969／j.issn.1006-7299.2013.04.024

时间：2013-7-3 16：57

R339.16

A

1006-7299（2013）04-0407-02

1 湖北科技学院耳鼻咽喉教研室（咸宁 437100）； 2 广西医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20130703.1657.012.html