沈玉璋，毛志华，陶邦一

（卫星海洋环境动力学国家重点实验室，国家海洋局 第二海洋研究所，浙江 杭州 310012）

0 引言

在自然海水中，浮游藻类生物与非色素颗粒物和黄色溶解有机物共同构成了水体的光学三要素［1］。在开阔的大洋水体中，藻类及其附属物质是决定水体光学特性的主要成分［2］。另外，随着海洋污染的不断发生，关于赤潮的报道已越来越频繁，因此对海洋中藻类光学特性的研究也是对水体光学及遥感的基本研究工作之一，可为卫星遥感监测海洋中生物量的分布、赤潮的预报等提供理论依据［3］。

吸收系数a（λ）、后向散射系数bb（λ）和衰减系数c（λ）是模拟水体离水辐亮度Lw（λ）过程中3个最基本的固有光学量，其中的a（λ）和bb（λ）分别决定了遥感反射比的谱形和幅值［4－5］。遥感反射比Rrs（λ）和固有光学量的关系可表述为［6－7］：

式中：t（w，a）是水气透射系数；t（a，w）是气水透射系数；nw为水的折射率实部；f（λ）是一个与波长、水体的单次散射反照比、体散射函数、太阳天顶角和气溶胶光学厚度等有关的函数［8－10］；Q（λ）为水体上行辐照度与上行辐亮度的比值［10］。

在一类水体中，Rrs（λ）主要由（1）式中的固有光学量决定［11］。因此，以固有光学参数为基础来探究水体光学传输机理是一种常用的研究方法。

在过去的几十年间，研究人员对海洋浮游藻类吸收特性进行了相当多的测量与研究，得出了一些藻类的吸收共性和差异。BRICAUD et al［12］1983年就通过在分光光度计探头前加上特殊装置来测量藻类细胞的吸收和衰减系数，并计算得出散射系数。在之后的一段时间内该方法得到了大部分人的认可和借鉴［13］。TASSAN et al［14］利用在两块石英玻璃片滴上待测样品代替膜过滤法中的滤膜，提出可以同时测量吸收和后向散射系数的方法。国内也有学者采用吸收衰减仪测量藻类水体的吸收和后向散射系数。

对不同藻种后向散射特性的了解仍然具有一定的局限性，主要原因是缺乏精确实验测量后向散射的方法。随着科技的进步，原本一直困扰研究者的后向散射测量方法也逐渐得到改善。目前，实验室中对后向散射的测量主要采用HOBI Labs公司生产的Hydro－Scat 6等产品，或者采用WET Labs公司生产的ECO－BB3产品。上述产品只有几个测量波长的通道，测量结果需要通过拟合才能得到所需波段范围的后向散射值，其中校正参数的选取会因颗粒形状的大小不同而异［15－16］。ROBERT et al［17］用 HS6测量了29种藻的后向散射曲线，发现大部分曲线呈指数衰减趋势，且在510nm处的后向散射值与颗粒有机碳浓度有较好的相关性，而与叶绿素a浓度和细胞丰度的关系不明显。MACCALLUM et al［18］设计了一套用于测量前向0.25～8°散射的实验装置，并对13种藻种进行前向散射的测量，获得了很好的结果，但其局限性在于测量角度范围太小。ZHOU et al［19］也在实验室中利用BB9测量15种藻种的后向散射，并比较了它们在几个波段上的后向效率，得出了可信的结论。

最早，研究人员主要利用计算机模拟方式来获取藻类散射特性［13，20］，藻类的细胞形状和折射指数的不确定是藻类散射系数误差的主要来源。GAIGALAS et al［21］将待测样品置于分光光度计中积分球前以及离积分球30cm距离的两个位置上，分别测量其吸光度，最终分离出样品的吸收和散射系数，其可靠性也得到理论计算值的验证。BRICAUD et al［13］提出用分光光度计测量时，通过在仪器的光探测器前加上带小孔的挡板可以有效减少前向散射进入探测器的量，以便较准确地得到藻类的衰减系数。WAYNE et al［22］利用激光粒度测沙仪LISST的原理，从理论上论证了此仪器用于测量颗粒0～15°前向散射的可行性，并用标准球形颗粒予以验证，使该方法成为测量散射时可被借鉴的一种方式。如今，商业仪器中的吸收衰减仪已经成为较常规的散射测量仪器。ZHOU et al［19］利用acs吸收衰减仪得到多种藻类的不同散射特性。

本文将从后向散射系数bb（λ）和散射系数b（λ）两个固有光学量的测量入手，对东中国海经常出现的赤潮藻种中肋骨条藻Skeletonemacostatum和东海原甲藻Prorocentrumdonghaiense的散射光学特性进行研究，探讨这两种藻种在光学特性上的异同及其原因，使人们对藻类的散射特性有一些基本的认识，为今后从遥感反射率的角度区别不同藻种提供理论依据，并提供一种比较可行的藻类细胞散射特性测量方法。

1 材料与方法

1.1 理论背景

藻类的散射特性主要是由其折射指数实部决定的，而折射指数的虚部决定其吸收的特性。对于各向同性的均匀介质，由洛伦兹振荡模型的理论可知［23］：

式中：ε（ω）为物质的介电常数，n（ω）为折射指数，两者都是外界电场振荡频率ω的函数；ωp定义为为介质中分子总数，e是电子数，m是单个单子的质量，ε0是真空中的介电常数；εr（ω）、εi（ω）对应于介电常数的实部和虚部；ωi则是介质中原子i中电子的共振频率，γi是相应的电子阻尼系数，ωi、γi是由物质本身的性质决定的；βi为原子i在分子中的数量。

从（2）～（4）式可以看出，当ωi远大于ω时，（4）式随ω的增大而增大，（5）式中εi（ω）的值很小，相对于εr（ω）可以忽略；而在ω≈ωi处，εr（ω）会出现与其它频率处相反的变化趋势，另外εi（ω）在此处也会出现一个峰值，称为共振吸收区；当ωi远小于ω时，εr（ω）随频率的增大而减小，εr（ω）也变得非常小（趋于零值）。在自然环境下，大部分电介质的共振频率都处于紫外波段处，因此，在可见光波段内εr（ω）随外界电场频率的增加而增大，被称之为正常色散，相反即被称为异常色散。

1.2 样品准备

本文选择中肋骨条藻和东海原甲藻作为研究对象，它们分别属于硅藻门和甲藻门，是我国东海赤潮海域中常见的优势藻种。中肋骨条藻的细胞为透镜形或圆柱形，直径为6～22μm，多个细胞常常形成链状；而东海原甲藻的细胞呈不对称梨形，长15～22μm，宽9～14μm，营单细胞生活。实验测量的藻种是从东中国海采集并提纯的，在光照培养箱中加入f2培养基长期培养。选取培养液上层的处于指数生长期阶段活性较好的藻类细胞进行光学参数测量，以减少非色素碎屑对测量结果的影响。藻类细胞叶绿素a浓度采用Turner公司生产的荧光仪测量，具体的操作步骤参考文献［24—25］的方法。

1.3 吸收系数的测量

吸收系数测量的常用方法是将藻类细胞过滤到玻璃纤维膜后在分光光度计上用反射法测量得到［14，26－28］，但此方法需要考虑膜本身的光程放大作用对测量结果的影响。

笔者对样品吸收系数的测量是在配有150mm积分球的双波束分光光度计（Perkin Elmer Lambda 950）上进行的。将藻类培养液盛于四面抛光、光程为1cm的比色皿上，通过固定支架（center mount cuvette holder）置于积分球中测量，由于经过样品的透射光和被样品散射的光都将被积分球测得，这样就可以得到样品的吸光度ODs值。为了排除藻类培养基对测量结果的影响，在实际操作中，需要对一部分藻类样品用直径为25mm的GF／F玻璃纤维膜进行过滤，取滤液作为参比，测量得到其吸光度ODf，则藻类细胞的吸收系数a表述为：

式中：l是比色皿的光程，为0.01。

1.4 散射系数的测量

在测量散射系数时，借鉴了文献［13］的方法，利用分光光度计（Perkin Elmer Lambda 35）先测得样品的衰减系数，再减去吸收系数得到。由于藻类细胞的前向散射占总散射的比率很大，在测量时应尽量减小探测器对前向散射的接收量。如图1所示，通过增加比色皿与探头间的距离D，减小探头前狭缝的孔径a，最终只有前向半角0.3°内的散射被接收。同时，为排除滤液吸收对测量结果的影响，采用与吸收系数测量时相同的方法将滤液作为参比值扣除。

为了验证该方法的可靠性，选择粒径分布和折射率已知，中心粒径直径为1.999μm的球形标准颗粒（Thermo Scientific Duke Standards Microsphere Size Standards），对利用上述方法测量的散射系数与米氏散射理论计算的结果进行对比（其中米氏散射的计算代码采用了Christian Mätzler公开的代码），结果见图2。

图1 散射测量示意图Fig.1 Laboratory setup for scattering measurement

图2的标准颗粒散射测量值与理论计算值是通过对颗粒质量浓度进行归一化后得到的，可以看出，散射系数测量值在400～700nm波段间与理论计算结果吻合得较好，但在蓝紫光和红光波段的偏差还是较大的，误差为2%～3%，由于球形标准颗粒的粒径分布和折射指数参数存在1.1%的变动，由计算可知，其对结果的影响平均为0.2%。而衰减系数测量过程中仪器和人员引入的系统误差对结果的影响为1.2%，如图7的分析，这种实验方法本身的误差为1.3%（在550nm处）。另外，当样品的光学厚度较低时测量误差会更小。总体上，应用该方法测量的误差较小，因此运用此测量方法对藻类细胞散射系数的测量是可行的。

1.5 后向散射系数的测量

对水体后向散射特性的测量，目前主要是使用商业仪器测量某一特定角度的体散射函数，最终估算出90～180°范围内的后向散射系数［15－16，29］，这些仪器主要用于海上现场测量，并不实用于实验室中测量各个波长的散射值。TASSAN et al［14］提出利用改进后的分光光度计透射反射法可以同时测量水体颗粒的吸收和后向散射，但此法在测量时并没有排除光在玻璃片上的全反射，致使样品前向散射的部分光线未能进入积分球而使测量的后向散射值偏大。

图2 标准颗粒散射测量值与理论计算值的比较（以标准颗粒质量浓度归一化）Fig.2 Comparison of measured scattering value of standard microsphere particle with Mie calculated value（normalized by particle concentration with unit g／m3）

笔者将样品置于5cm的比色皿中，放于分光光度计（Perkin Elmer Lambda 950）的积分球后端，采用反射法测量（图3）。

图3 后向散射测量示意图Fig.3 Laboratory setup for backscattering measurement

实际测量时，将藻类样品用直径为25mm的GF／F滤膜进行过滤，将得到的滤液作为参比之用，为了消除石英比色皿前端对光反射的影响，实测的样品反射值需减去参比的反射值。考虑到部分光线受比色皿尾端反射的影响，改用5cm的比色皿后，测量的藻类细胞浓度也相应提高。

与散射的测量方法相同，将通过测量得到的球形标准颗粒的后向散射与通过米氏散射计算得到的理论结果进行比较（图4）。

图4 标准颗粒后向散射测量值与理论计算值的比较（以标准颗粒质量浓度归一化）Fig.4 Comparison of measured backscattering value of standard microsphere particle with Mie calculated value（normalized by particle concentration with unit g／m3）

图4中的数据是经过质量浓度归一化处理后得到的结果，可以看出，在400～700nm波段，后向散射测量结果与米氏散射计算得到的理论值在谱形上比较一致，但幅值总体上后向散射测量值偏高，特别是在600nm后的后向散射测量值随波长增大与米氏散射计算得到的理论值偏高程度更明显，平均约20%的偏差。由之前所说，由标准颗粒本身参数的偏差以及可能的系统测量偏差产生的误差在2%以内，不是主要的误差来源。最主要的误差来源是由于比色皿5cm的光程偏短，部分透射光在比色皿末端玻璃面上反射回积分球造成的，而标准颗粒在短波处反射回来的散射较小，所以对结果影响很小。因此，采用此方法测量散射特性比标准颗粒更弱且具有吸收特性的藻类细胞，其误差会更小。

在测量吸收、散射和后向散射时，为了排除高浓度带来的多次散射影响，每次对同一种藻类细胞都先稀释为原始浓度的1／2，1／4，1／8，1／16，再测量这几个浓度梯度的吸光值，最终按原浓度的1／16归一化后（受多次散射影响较小）的测量值低于其它测量值，一般情况下，原浓度的1／8之后的浓度归一化结果都趋于一致，取其中一条光谱曲线作为最终结果即可。如图5和图6所示，以中肋骨条藻为例，由于受到多次散射的影响，原质量浓度（701.8ug／L）的样品其吸收和衰减吸光度的结果偏高，对其稀释1／4和1／8后吸收和衰减吸光度测量值降低，再继续稀释下去，其结果由于信噪比较低且与1／8稀释液的结果几乎一致，故选取原浓度稀释1／8后的吸收和衰减吸光度测量结果作为最终的测量数据。

图5 不同叶绿素a浓度中肋骨条藻样品以原浓度的1／16为基准值的归一化吸光度Fig.5 Optical density normalized on 1／16the original concentration for different chlorophyll aconcentration of Skeletonema costatumalga

图6 不同叶绿素a浓度中肋骨条藻样品以原浓度的1／16为基准值的归一化散射吸光度Fig.6 Scattering optical density normalized on 1／16the original concentration for different chlorophyll a concentration of Skeletonema costatumalga

由于实验结果的误差主要来源于仪器的系统误差、人员操作误差和实验方法本身的误差，笔者在实验室中选择了亚历山大藻作为测量对象，对系统和人员操作误差进行评测，如图7所示，在每次测量时，人为地对样品进行取放，每次测量的时间间隔为3min。在550nm处8次衰减系数测量的误差为1.2%，在550nm处吸收系数误差为0.8%。因此可见，用于测量的两台分光光度计的仪器误差以及人员操作的误差相对较小，均在允许范围内。

图7 亚历山大藻衰减和吸收曲线的多次测量结果（图中上半部分的曲线为Lambda 35的8次衰减值测量结果，下半部分的曲线为Lambda 950的8次吸收值测量结果，图中的吸收值是原测量值的10倍）Fig.7 Results of eight repeating measurements for both attenuation（the upper eight curves measured on Lambda 35）and absorption（the lower eight curves，multiplied by 10，measured on Lambda 950）of Alexandrium affine alga

2 结果与讨论

中肋骨条藻和东海原甲藻长期以来一直是东中国海区的主要藻种，在夏季和秋季的赤潮中常常是优势种，因此从遥感平台区分这两种藻成为人们关注的问题。影响藻类细胞散射特性的因素很多，包括粒径大小、细胞形状、细胞内物质构成等，虽然这两种藻类细胞大小相近，但从图8中可以看出，中肋骨条藻和东海原甲藻的散射特征有明显的区别，中肋骨条藻的散射随波长的增加而递减，而东海原甲藻的变化趋势却相反。明显地，在蓝紫光波段散射强度随波长的变化率并不一致，很大原因是受藻类细胞色素在此处的强吸收影响。在红光波段也出现了一个散射的谷值，但是两条曲线在此处的散射谷位置并不相同，中肋骨条藻为660nm处，东海原甲藻为667nm处，也不与其相应的吸收峰位置（675nm处）重叠。这点可以从电磁学的角度得到解释。由之前的理论可知，在可见光范围内，中肋骨条藻大致服从正常色散，而东海原甲藻由于细胞内主要物质分子的共振频率小于可见光频率，使整体出现异常色散现象；在400～500nm范围内受多种色素的影响，两种藻都出现了与其它波长处相反的色散趋势，但因为各种色素的综合作用使其效果不明显；在675nm处附近，由于叶绿素a的作用突出，产生了明显的异常色散，且两种藻类细胞内主要物质的物理特性不同（主要是物质的电子振荡阻尼系数γ的差异），使异常色散的范围也不一致，中肋骨条藻为668～696nm，而东海原甲藻为652～675nm。

图8 中肋骨条藻和东海原甲藻的散射和吸收曲线（实线为散射值，虚线为吸收值，以藻类叶绿素a浓度归一化）Fig.8 Measured total scattering and absorption spectrum of Skeletonema costatumand Prorocentrum donghaiense（solid line for scattering，dot line for absorption，both are normalized by chlorophyll aconcentration）

图9 中肋骨条藻和东海原甲藻的后向散射曲线（以藻类叶绿素a浓度归一化）Fig.9 Measured backscattering spectrum of Skeletonema costatumand Prorocentrum donghaiense（normalized by chlorophyll aconcentration）

在谱形上中肋骨条藻和东海原甲藻的后向散射特性区别并没有总散射曲线那么明显（图9），在整个可见光范围内受吸收特性的影响较大，在蓝光波段和红光波段对应出现了色素吸收峰，中肋骨条藻中类胡萝卜素在蓝光内和500nm处的吸收使后向散射出现一个峰值。两种藻类在665nm附近的谷值比较一致。在幅值上，两种藻类的浓度归一化的后向散射系数相差不大，东海原甲藻整体比中肋骨条藻略大，对应550nm处的值分别为0.001 74和0.001 43m2／mg（以藻类叶绿素a浓度归一化），而后向散射概率分别为1.104%和0.723%。与文献［26］，［30—31］等研究者对海洋藻类的测量结果相近。由（1）式可以看出，这两种藻类的反射中，后向散射产生的差异主要体现在幅值上，谱形上的区别主要还是由吸收的差异决定。

3 小结

本文主要利用分光光度计设计了在实验室中测量海洋微型浮游藻类的散射和后向散射特性的方法，并用该方法测量已知折射指数的标准球形颗粒的散射和后向散射系数，测量得到的散射系数与通过米氏理论计算出的结果一致性较好，在近红外波段处由于颗粒在0～0.3°的前向散射较强，使测量结果略小于理论值；后向散射的测量结果在400～600nm波段内与理论值很吻合，而在600nm后由于比色皿光程偏短，使部分来自比色皿的反射光被当做后向散射，使测量值偏高，在700nm处的误差约为20%。

利用设计的散射和后向散射的测量方法对东中国海两种常见的赤潮藻种中肋骨条藻和东海原甲藻进行测量，结果显示，两种藻类的散射曲线幅值相近，但谱形差异明显，中肋骨条藻的散射系数整体随波长增加而递减，东海原甲藻则与此相反。此外，在强色素吸收区，这两种藻均出现相对于其它波长异常的散射趋势，特别是在675nm处叶绿素a的吸收峰附近，且异常的范围宽度和位置稍有不同，中肋骨条藻为668～696nm，东海原甲藻为652～675nm。此结果表明，中肋骨条藻细胞的物质组成与大多数电介质一样，满足正常色散关系，仅在色素的共振吸收区出现异常色散现象；而东海原甲藻相对特殊（与测量过的其它藻类相比），细胞内物质较低的共振频率决定了其散射上出现异常色散关系。

两种藻类的后向散射特性区别并不大，整体上受吸收的影响比较明显，在400～500nm区间和673nm处均出现明显的低值。在幅值上，东海原甲藻略高于中肋骨条藻，在550nm处分别为0.001 74和0.001 43m2／mg（以藻类叶绿素a浓度归一化），后向散射概率分别为1.104%和0.723%。

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