文昱婷 朱颖 杨旸 杨健 张秀伟

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，在工业发达国家，肺癌发病率已位居各种恶性肿瘤的首位。一项我国恶性肿瘤死亡率回顾性研究表明，恶性肿瘤死亡率呈上升趋势，目前，肺癌成为我国男性和女性恶性肿瘤的头号杀手［1-2］。肺癌是一种基因性疾病，癌基因的激活或者抑癌基因的失活导致细胞异常增殖和凋亡障碍，是肺癌发生发展的关键。survivin于1997年被发现，是一种调节细胞周期和程序性死亡的蛋白，在大多数肿瘤中高表达，且研究发现survivin在肺癌的发生、发展中起着重要的作用，成为目前肺癌研究领域的一个新热点［3-4］。NSCLC患者胸腔积液的出现通常意味着疾病的严重性和患者较短的生存期，恶性胸腔积液的早期诊断与肺癌的治疗及预后关系密切，且不同的病理类型对治疗的反应各不相同。寻找胸腔积液中高敏感性、高准确性的标志物来早期诊断良、恶性胸水仍然是临床研究的热点。本研究通过western blot法研究NSCLC恶性胸腔积液中survivin的表达情况及其与相关临床特征的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2011年1月至2012年6月在我院确诊恶性胸腔积液48例，其中男32例，女16例，年龄51～89岁，中位年龄为68岁，均经胸腔积液脱落细胞学、纤维支气管镜病理活检或经皮肺穿刺细胞学等方法得到病理学证实为NSCLC患者。组织学分型，腺癌患者41例，鳞癌患者7例。均为初诊患者。所有病例排除其他癌症，采取标本之前未行抗癌治疗。对照组30例，男24例，女6例，年龄24～80岁，中位年龄为59岁。其中结核性胸膜炎14例，肺炎旁胸腔积液及脓胸8例，心功能不全8例。

1.2 试剂与方法

1.2.1 一抗:Rabbit polyclonal anti-survivin购自美国Santa Cruz公司;二抗:IRDyeTM800 Conjugated anti-Rabbit/Mouse second antibody购自美国 Rockland公司。

1.2.2 标本的处理:取胸腔积液标本200～400 ml，恒温离心，3000 r/min，10 min，收集沉淀细胞，如血性标本用低渗氯化铵溶液去除红细胞。取部分沉淀细胞涂片，涂片经预冷丙酮固定干燥后置于－20℃冰箱保存待测。

1.2.3 western blot法:取－20℃保存的沉淀细胞，预冷PBs洗3次，用RIPA细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白。用Bradford法行总蛋白定量。调整每个泳道上样量为20 μg左右。聚丙烯酰胺凝胶电泳:采用5%积层胶和10%分离胶;积层胶电泳电压为60 V，分离胶电泳电压为120 V，总计电泳时间为2 h左右。脱脂牛奶封闭PVDF膜，蛋白上样量分别为50 μg，一抗(Rabbit polyclonal anti-MACC-1)浓度为1∶400，与辣根过氧化物酶标记的二抗(二抗浓度为1∶400)结合，ECL试剂发光，X胶片曝光，显影、定影，将条带扫描进行分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件，计数资料采用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC恶性胸腔积液与对照组survivin蛋白水平比较 48例NSCLC患者恶性胸腔积液中，survivin阳性表达为 37例，阴性表达为 11例，阳性率为77.08%。在对照组中无 survivin阳性表达者。见图1。

2.2 不同性别、病理类型的NSCLC患者恶性胸腔积液survivin表达比较 在survivin阳性表达的37例中，腺癌和鳞癌的阳性表达例数分别为33例(80.49%)和 4例(57.14%)，差异无统计学意义(P＞0.05)。男性和女性的阳性表达例数分别为27例(84.38%)10例(62.50%)，差异亦无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.3 NSCLC患者恶性胸腔积液中survivin表达对预后的影响 在随访周期内采用门诊复查和电话相结合的方式进行随访，其终点为病变进展或死亡。结果显示，survivin阳性表达者预后明显不佳(P＜0.01)。见表1。

表1 NSCLC患者恶性胸腔积液中survivin表达与临床特征关系

3 讨论

导致胸腔积液的原因很多，常见原因有原发性肺癌、肺结核等多种疾病，近年来，肺癌的发病率呈上升趋势，恶性胸腔积液明显增多，尤以肺腺癌更易发生胸膜转移。胸腔积液的良、恶性鉴别要依靠细胞学检查，但其敏感性低、难以满足临床需要。因此需要寻求新的诊断方法，胸腔积液中肿瘤标志物的检测成为了肺癌诊断和鉴别诊断的重要手段。

survivin具有抑制细胞凋亡和调节细胞分裂的双重功能，能抑制 Fas、bax及caspase-7和化疗药诱导的细胞凋亡［5］。survivin的基本作用之一是抑制细胞凋亡，同时参与有丝分裂的调控［6］，且仅在有丝分裂过程中表达。免疫组化研究结果已经证明survivin可能存在于人类多种肿瘤细胞核和细胞质中，其在肿瘤细胞核中的表达显示临床预后不佳［7］。在正常生理条件下survivin的表达局限于胚胎、造血、上皮细胞和性腺细胞系。但在多种癌症中发现survivin高表达，包括96%的肺癌、100%的结肠腺癌、71%的前列腺腺癌、80%的胶质母细胞瘤，和100%的喉癌标本［8-10］，因此可作为肿瘤诊断的新指标。survivin基因在肺癌诊断中的意义国内外均有报道，但其在NSCLC恶性胸腔积液中检测结果及其临床意义的报道较少。

本研究显示，NSCLC患者恶性胸腔积液中survivin表达的阳性率为77.08%，而在非恶性胸腔积液中无表达，提示survivin在NSCLC恶性胸腔积液中表达上调。由于survivin蛋白是凋亡抑制蛋白，具有抑制细胞凋亡的功能，在肿瘤细胞或核异型等细胞中明显表达，而正常的细胞中几乎无或很少表达，故恶性胸腔积液中survivin蛋白的检出阳性率明显高于良性胸腔积液。因此检测 survivin可能具有早期诊断价值，并可能成为一个新的恶性胸腔积液诊断标志。

有研究表明，survivin的表达与NSCLC的预后相关［11］，而 Huang 等［12］根据系统性文献回顾亦得出，survivin的高表达提示NSCLC患者的预后较差。本研究结果证实，NSCLC恶性胸腔积液中未表达survivin者生存时间明显长于阳性表达者，表明检测survivin对预测肺癌预后有一定的价值，也可以作为预后不良的指标之一。

［1］Siegel R，Naishadham D，Jemal A，et al.Cancer statistics，2013［J］.CA Cancer J Clin，2013，63(1):11-30.

［2］张伟东，苗树军.我国恶性肿瘤死亡率流行病学特征分析［J］.中国健康教育，2009，25(4):246-248.

［3］Chen XQ，Yang S，Kang MQ，et al.Survivin expression in human lung cancer and the influence of its downregulation on the biological behavior of human lung cancer cells［J］.Exp Ther Med，2012，3(6):1010-1014.

［4］Waligórska-Stachura J，Jankowska A， R，et al.Survivin-prognostic tumor biomarker in human neoplasms-review［J］.Ginekol Pol，2012，83(7):537-540.

［5］Tamm I，Wang Y，Sausville E，et al.IAP-family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas(CD95)，Bax，caspases，and anticancer drugs［J］.Cancer Res，1998，58(23):5315-5320.

［6］O'Connor D，Grossman D，Plescia J，et al.Regulation of apoptosis at cell division by p34cdc2phosphorylation of survivin［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(24):13103-13107.

［7］Nowak-Markwitz E，Pula B，Szajnik M，et al.Expression of survivin，SDF-1 and CXCR4 on tumor cells in ovarian cancer［J］.Ginekol Pol，2010，81(9):674-677.

［8］Kawasaki H，Altieri D，Lu C，et al.Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer［J］.Cancer Res，1998，58(22):5071-5074.

［9］Kaczmarek-Borowska B，Filip A，Wojcierowski J，et al.Survivin antiapoptotic gene expression as a prognostic factor in non-small cell lung cancer:in situ hybridization study［J］.Folia Histochem Cytobiol，2005，43(4):237-242.

［10］Margulis V，Lotan Y，Shariat SF.Survivin:a Promising biomarker for detection and prognosis of bladder eaneer［J］.World J Urol，2008，26(1):59-65.

［11］Ezponda T，Pajares MJ，Agorreta J，et al.The oncoprotein SF2/ASF promotes non-small cell lung cancer survival by enhancing survivin expression［J］.Clin Cancer Res，2010，16(16):4113-4125.

［12］Huang LN，Wang DS，Chen YQ，et al.Expression of survivin and patients survival in non-small cell lung cancer:a metaanalysis of the published studies［J］.Mol Biol Rep，2013，40(2):917-924.