罗天相 ，胡 锋，李辉信

(1.宜春学院生命科学与资源环境学院，宜春 336000;2.南京农业大学资源与环境科学学院，南京 210095)

氧化亚氮(N2O)是一种重要的大气微量气体，是致臭氧层破坏和温室效应的主要因素。全球N2O排放量60%以上来源于土壤的生物活动，其中农田土壤约占土壤排放源的40%，达4.2 Tg N-N2O/a［1］。N2O主要由微生物活动引起的土壤硝化和反硝化过程产生，这些过程受到不同的土壤理化因素的调节，比如土壤水分和通气状况，土壤类型和土壤pH的影响。蚯蚓是土壤生物的重要组成部分，与土壤理化性状的改变有密切的关系。蚯蚓活动能混合土壤，改善土壤结构，提高土壤透气、排水和深层持水能力，间接影响土壤硝化和反硝化过程，可能成为陆地生态系统N2O排放的生物源之一［2-3］。近年来在微系统［4］和不同土壤类型上的中观试验［5-12］也证实了蚯蚓活动与土壤N2O排放有密切关系。

由于试验土壤类型和蚯蚓生态型的差异，有关蚯蚓对土壤N2O排放影响的研究结果还不尽一致。蚯蚓对土壤N2O排放的影响与施加的外源作物秸秆及取食对策均有关联［5］。蚯蚓能促使植物残体进入土壤，并将植物残体中的N转化为无机态形式，从而易于被植物和土壤微生物吸收利用，在秸秆还田时辅以蚯蚓处理，有助于植物残体向土壤有机碳的转化［13］。当秸秆混施入土壤时，接种深层种(anecic)蚯蚓Apporectodea longa能促进土壤N2O 排放［10］;秸秆表施时，表层种(epigeic)蚯蚓 Lumbricus rubellus［5-6］和深层种蚯蚓 A.longa［6］将导致土壤N2O排放量的增加。壤土中，内层种(endogeic)蚯蚓A.caliginosa仅在秸秆混施入土壤或与表层种蚯蚓L.rubellus一同存在时才会对土壤N2O排放具有促进作用［5］，当A.caliginosa接种在沙质土壤中，即使和L.rubellus一同存在，该种蚯蚓也没有如壤土中一样增加N2O的排放，甚至表现出抑制作用［8］，这反映出蚯蚓生态型不同的取食策略。接种不同生态型蚯蚓时，甚至混施作物秸秆的不同深度也会影响到土壤N2O 的排放［14］。

此外，在探讨蚯蚓活动对土壤温室气体N2O排放影响研究上，由于蚯蚓在森林和草地中具有较高的种群密度，过去的结论多来自于这2个生态系统［6-12］，对农田生态系统关注不多。但蚯蚓是农田生态系统的重要组成部分，麦田中蚯蚓种群全年平均密度可高达83.83条/m2［15］，明确农田生态系统中蚯蚓对N2O排放的影响，对于了解蚯蚓的生态功能，揭示蚯蚓活动对土壤温室气体代谢的影响，促进农田管理减排具有重要的意义。为此，在接种蚯蚓长期定位试验的基础上，通过农田冬小麦栽种试验，对施用秸秆(表施和混施)及接种蚯蚓后土壤N2O排放通量的变化进行初步研究，并从土壤特性和排放量上对蚯蚓的作用进行评估，为正确评价农田土壤动物的生态功能提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验地点和材料

盆栽试验于2007年11月—2008年5月在南京农业大学常年定位网室内实施。供试土壤为江苏省如皋县搬经镇的高沙土。网室内用混凝土砌成2.8m×1m×0.6m的池子，填入深50cm的供试土壤。

盆钵用紫砂泥烧制而成，钵高和内圆直径均为20cm左右，盆钵上口有1.5cm深的凹型槽用以在采样时注水与采样箱密封，盆钵底部有直径为2cm的小孔多个以渗漏降水。每盆装供试土壤4kg左右，各供试土壤设置3个重复。为使盆钵土壤的温度与大田土壤温度一致并减少盆钵间的温度差异，盆钵的4/5高度埋入土壤。

冬小麦品种为扬麦158，小麦播种期为11月15日，11月18日移栽入盆钵内，每盆移栽4株，2008年5月10日收获。

土壤有机C含量为5.86g/kg，总N含量为0.70g/kg，总P含量为0.66g/kg，速效P含量为0.66mg/kg，速效K含量为47.1mg/kg，pH为 8.25。

1.2 肥料施用

氮、磷和钾肥用量分别为225kg/hm2(以纯N计)、120kg/hm2(以P2O5计)和120kg/hm2(以K2O计)，肥料品种为尿素、过磷酸钙和氯化钾。其中氮肥的60%作为基肥，分蘖肥和穗肥各占20%，磷、钾肥全作基肥。有机物料采用玉米秸秆，其基本性状为14.63g N/kg，464.33g C/kg，2.85g P/kg，玉米秸秆C/N为31.74，用量为每盆钵施用23.5g，折合约7500kg/hm2。玉米秸秆(粉碎至2cm左右)与基肥一起施入，混施时与0—20cm土壤均匀混和，这种秸秆施用方式与自然还田的实际情况接近;表施时则均匀覆盖于盆钵内土层表面。

1.3 蚯蚓接种

试验所用蚯蚓为威廉腔环蚓(Metaphire guillelmi)，分类上属于anecic，介于epigeics和endogeics之间，由于盆钵表面积小，蚯蚓活动范围受到一定的拘束;试验土壤采集地的蚯蚓自然密度约为60—80g/m2，故折合到每盆钵约2.5g蚯蚓生物量，即2条成年蚯蚓被接种入盆钵。作物移栽入盆钵后立即进行接种，接种之后浇适量水，以便蚯蚓尽快适应环境。

1.4 试验处理

本实验共设5个处理，各处理3次重复:(1)对照，即不施用玉米秸秆，不接种蚯蚓(CK);(2)秸秆混施，不接种蚯蚓(I);(3)秸秆表施，不接种蚯蚓(M);(4)秸秆混施，接种蚯蚓(IE);(5)秸秆表施，接种蚯蚓(ME)。

1.5 土壤、气体采样与分析方法

试验的开始和结束期进行土壤理化性状测试，采集各处理土壤表层(0—20cm)样品。用K2Cr2O7氧化法测定土壤有机碳(SOC);用半微量凯氏定氮法测定全氮(TN)。NH+4-N用靛粉蓝比色法;NO-N用镀 Cu-Cd还原法。

本试验气体样品采集采用静态箱-气相色谱法。采样箱为圆筒型，用PVC材料制成，高1m，箱体直径与盆钵凹型槽直径一致。采样箱外侧先包有一层约5cm厚的海绵，然后覆盖一层铝箔以减少采样期间由于太阳辐射引起的箱内温度变化。气体样品用带有开关的针筒采集，生长季节前中期每周1次，3月中旬后每两周1次。根据试验要求，采用2—3箱体平行采样，采样时间分别为关箱后的0、5、10、15、20min，每次抽样60 mL。气体样品于采样当天用改装的Agilent 4890D气相色谱仪分析N2O的排放通量。由于样品采集时采样箱中包含正常生长的作物，因此该研究的温室气体排放通量代表该生态系统的温室气体排放。

N2O排放通量结果用每次测定3个重复的平均值及标准偏差表示，排放量以生长季排放通量乘以生长季的时间。

1.6 统计学检验方法

数据统计分析采用二因素(蚯蚓×秸秆施用方式)方差分析蚯蚓和秸秆的交互作用，用单因素方差分析不同处理间差异，差异显著性用Duncan检验，所有统计分析均采用SPSS统计软件。

2 结果与分析

2.1 不同处理间土壤化学性状的改变

经过冬小麦栽培，在收获期后不同处理土壤中有机碳和全氮含量变化明显(表1)。与对照相比，加施秸秆处理(M、ME、I、IE)土壤有机碳和全氮含量均显著增加(P＜0.05)。混施秆秸处理(I和IE)有机碳和全氮含量显著高于表施秸秆处理(M和ME)。接种蚯蚓未对有机碳(SOC)与全氮产生显著影响，表明蚯蚓对有机物料的取食不会降低土壤有机碳和全氮含量。所有处理土壤碳氮比均为10左右，各处理间差异不显著。这表明在秸秆常规施用量条件下接种蚯蚓并未引起土壤碳、氮总量的减少，土壤碳、氮基本维持平衡。加施秸秆使土壤有机碳的含量显著提高，这个现象与其它研究结果是一致的。与表施秸秆相比，混施秸秆更有利于土壤有机碳提高［16］。

表1 不同处理土壤有机碳、全氮和矿质氮变化Table 1 Changes of soil organic carbon，total nitrogen and mineral nitrogen content under different treatments

2.2 蚯蚓和秸秆施用对N2O排放的影响

蚯蚓和秸秆施用对N2O排放的影响如图1所示:在小麦生长季整体排放趋势呈现两头高，中间低的走势。其排放峰主要出现在小麦生长的苗期和生长的末期。在小麦生长前期，各处理间N2O排放较高的原因可能是基肥用量较大，提供了充足的N源，而且此时温湿度仍较适宜土壤N2O的生成与排放;中期由于气温偏低，蚯蚓进入休眠停育阶段，而冬春季降雨又较多，由于农田土壤N2O排放较强烈地受土壤湿度制约，土壤湿度过大，不利于N2O的生成与排放［17］;后期随着温度的升高，湿度条件适宜，蚯蚓开始取食、活动，小麦生长发育加速，有助于提高N2O的生成和排放通量。

相比对照CK处理，施加秸秆和接种蚯蚓均能显著提高N2O排放量(表2)。在秸秆表施的情况下，接种蚯蚓ME处理N2O的排放量最大，全生育期达14.26 kg/hm2，显著高于未接种蚯蚓M处理(P＜0.05)，且这种N2O排放的差异性无论在栽培前期还是后期均很显著。在混施秸秆的情况下，接种蚯蚓IE处理在栽培前期较未接种蚯蚓的I处理差异仍显著，但在后期两处理间排放量无明显差异。整个麦季对照CK处理N2O的排放量最低，为11.42 kg/hm2。

表2 不同处理N2O排放量(平均数±标准差)Table 2 Amounts(mean±SD)of N2O emission

3 讨论

3.1 蚯蚓与N2O排放

蚯蚓对N2O排放的影响比较显著，虽仍没有达成一致的看法，但普遍认为蚯蚓促进了土壤N2O的排放。本研究中施加秸秆后，接种蚯蚓能显著提高土壤N2O排放的通量。农田中作物秸秆(混施或表施)是土壤中产生N2O的主要微生物过程——硝化和反硝化作用的重要C和N源。与无作物秸秆还田相比，在土壤N源充裕条件下作物秸秆施用往往导致较高的反硝化作用和N2O排放。

图1 麦季N2O排放通量的变化Fig.1 Variations of N2O flux in wheat season

在评估蚯蚓对植物残体分解和温室气体排放影响的研究中，有些研究是将植物残体表施在土壤上［18-19］，但秸秆混施于土壤则是更为常见的农业措施。本试验中，在秸秆表施的情况下，接种蚯蚓后N2O的排放显著增加(P＜0.05);而当秸秆混施时，蚯蚓的相对作用将减小。通过取食并分解有机残体，蚯蚓使秸秆中的N素等营养物质在耕作层中更均匀的分布和均衡利用。这种混施秸秆的耕耘活动代替了蚯蚓的部分生态功能。所以当秸秆混施时，蚯蚓尽管在前期对N2O的排放产生一定的影响，但在后期，蚯蚓的存在与否并没有显著差异，这点与Rizhiya等观测结果类似［6］。

目前，解释蚯蚓在土壤中的生态功能机理有2种推论［20］，即养分富集过程(NEP)和肠道关联过程(GAP)。NEP意味着蚯蚓通过混合并取食所添加的秸秆，导致土壤和蚓粪的养分富集，该过程将蚯蚓的作用主要归因于蚯蚓在土壤中的迁移和取食作用，而不过多涉及其生理代谢过程。GAP则主要是包括与蚯蚓肠道相关联的一系列生化反应过程，以及肠道分泌物和排泄分泌物中微生物和酶数量和活性的改变等。微系统试验中，GAP一般能很好的解释蚯蚓对于N2O排放的促进作用［21］。但本试验中，在秸秆不同施用方式下(混施和表施)接种蚯蚓对农田N2O排放的影响是有差异的，在田间的中观尺度下，NEP的推论能更好的解释这种现象:因为蚯蚓的活动，在表施秸秆的情况下，通过取食活动将秸秆混入土壤，使秸秆的分解由原来的好氧和低硝化作用的环境转移到一个硝化作用显著加强的环境(NEP)，从而促进N的分解和N2O的排放;而在混施秸秆的情况下，蚯蚓的作用更多体现在肠道关联过程(GAP)上时，接种蚯蚓未能始终表现出对N2O排放的促进作用。当然，蚯蚓在土壤中的生态作用同时包含了NEP和GAP两个过程，在中观试验的尺度下接种蚯蚓后土壤所表现出的生态效应，但仍需大田试验以进一步观测。

3.2 土壤矿质氮与N2O排放

蚯蚓等土壤动物通过掘穴、取食和排泄等活动对生态系统的理化和生物特性产生影响，这些因素又直接或间接的影响着土壤的硝化与反硝化作用［22-23］。NH-N和NO-N分别是硝化和反硝化反应的底物，N2O的产生受这些底物浓度的制约。在本次试验中，重点观察了土壤矿质氮(包括NO-N和NH-N)含量的变化与N2O排放的关系。在盆栽试验中，NO-N含量均显著高于NH-N，土壤中NO-N浓度没有成为N转化的限制性因子。接种蚯蚓处理的NO-N含量显著提高，混施秸秆时，接种蚯蚓NO-N含量最高，但在表施秸秆时，接种蚯蚓使NO-N有更大的增幅(20.1%)。蚯蚓对氮矿化的影响，可能与蚯蚓直接排泄富含有效氮的物质及自体代谢分泌有关，也可能是蚯蚓活动促进了土壤微生物活性的提高及其向营养源富集场所的扩散，从而加快了微生物对氮的周转和释放［24］。不同处理土壤矿质氮的分异主要取决于NO-N含量的变化。由于土壤中的NO-N不但促进反硝化速率，而且抑制或延迟N2O还原为N2［6］，所以蚯蚓可通过影响土壤NO-N含量间接促进土壤N2O的排放。通过相关性分析也发现，本试验中的土壤NO-N含量与N2O排放量显著正相关(见表3)。

表3 N2O排放量与土壤理化性状的相关分析表Table 3 The correlation analysis of N2O emission and soil physical and chemical properties

在Malhi的研究中［25］，通过8a的田间试验，他们同样发现大多数情况下，耕作、施加作物秸秆和N肥的输入并没有对作物土壤中的NH-N产生显著影响。但在施加秸秆的处理中，NO-N浓度在0—15 cm的土壤层中显著高于对照处理。施加秸秆导致NO-N淋失加剧和N-N2O排放量的增加，尤其是在秸秆过量的情况下。当深层种和内层种蚯蚓多时，会导致土壤滤出液中的NH-N浓度升高，而表层种蚯蚓则导致NO-N的浓度升高［26］。考虑到土壤矿质氮含量与N2O排放的关系，不同生态型蚯蚓在土壤微量气体代谢中的作用也会出现差异。

在本试验场所早期进行的一项试验表明，秸秆两种施用方式下，蚯蚓于分蘖期显著降低了矿质氮的含量(分别为24%和32%)，且在秸秆表施处理中降低程度更高。在土壤中植物残体含量较高时，微生物加速繁殖，生物的固定作用加强，蚯蚓使土壤可溶性有机氮的含量提高，导致了N向下运移和流失［27］。在这个过程中，流失的N可能经由硝化和反硝化过程，部分转化为N-N2O，以气态的形式逸失。

4 结论

接种蚯蚓和秸秆施用对土壤N2O排放有显著影响，不同的研究，由于所采用的有机肥料和试验设计及方法的不同，会导致研究结果的差异。总体来说，施加秸秆后，蚯蚓的存在能够显著提高土壤中N2O的排放量，蚯蚓的这种作用当秸秆表施时更明显，而当秸秆混施进土壤后，尽管接种蚯蚓后将产生较高的排放量，但蚯蚓的相对作用将减小。养分富集过程(NEP)较肠道关联过程(GAP)更好的解释了接种蚯蚓后田间土壤所表现出的生态效应。农田秸秆施用引起的N2O排放量的差异，应该受外源C、N供应水平、土壤供N水平、微生物对有机碳的分解及对N的争夺利用等多因素制约。因此，有关秸秆残体施用后接种蚯蚓对土壤N2O排放影响的机理尚需进一步深入研究，碳氮同位素分析，分子生物学技术和图像分析技术等的应用将有助于蚯蚓生态功能的研究［28］，增加对蚯蚓生态型与土壤微生物群落之间的关系的了解。

［1］IPCC.Contribution of Working Group I to the Fourth Assessment Report of the intergovernmental Panel on Climate Change 2007，Cambridge University Press，2007.

［2］Han X G，Wang Z P.Soil biodiversity and trace gases(CO2，CH4，N2O)metabolism:a review.Biodiversity Science，2003，11(4):322-332.

［3］Karsten G R，Drake H L.Denitrifying bacteria in the Earthworm gastrointestinal tract and in vivo emission of nitrous oxide(N2O)by earthworms.Applied and Environmental Microbiology，1997，63:1878-1882.

［4］Luo T X，Li H X，Wang T，Hu F.Influence of nematodes and earthworms on the emissions of soil trace gases(CO2，N2O).Acta Ecologica Sinica，2008，28(3):993-999.

［5］Giannopoulosa G，Pullemana M M，van Groenigen J W.Interactions between residue placement and earthworm ecological strategy affect aggregate turnover and N2O dynamics in agricultural soil.Soil Biology and Biochemistry，2010，42(4):618-625.

［6］Rizhiya E，Bertora C，van Vliet P C J，Kuikman P J，Faber J H，van Groenigen J W.Earthworm activity as a determinant for N2O emission from crop residue.Soil Biology and Biochemistry，2007，39(8):2058-2069.

［7］Sperattia A B，Whalen J K.Carbon dioxide and nitrous oxide fluxes from soil as influenced by anecic and endogeic earthworms.Applied Soil Ecology，2008，38(1):27-33.

［8］Giannopoulos G，van Groenigen J W，Pulleman M M.Earthworm-induced N2O emissions in a sandy soil with surface-applied crop residues，Pedobiologia，2011(Supplement)，54:103-111.

［9］Gao B，Fu S L，Zhang W X，Liu S P，Zhou C Y.Short-term Effects of Earthworm and Evodia lepta on Soil N2O and CH4Fluxes in a Subtropical Plantation.Journal of Tropical and Subtropical Botany，2010，18(4):364-371.

［10］Bertora C，van Vliet P C J，Hummelink E W J，van Groenigen J W.Do earthworms increase N2O emissions in ploughed grassland?Soil Biology and Biochemistry，2007，39(2):632-640.

［11］Chapuis-Lardy L，Brauman A，Bernard L，Pablo A L，Toucet J，Mano M J，Weber L，Brunet D，Razafimbelo T，Chotte J L，Blanchart E.Effect of the endogeic earthworm Pontoscolex corethrurus on the microbial structure and activity related to CO2and N2O fluxes from a tropical soil(Madagascar).Applied Soil Ecology，2010，45(3):201-208.

［12］Lubbers I M，Brussaard L，Otten W，Van Groenigen J W.Earthworm-induced N mineralization in fertilized grassland increases both N2O emission and crop-N uptake.European Journal of Soil Science，2011，62(1):152-161.

［13］Lavelle P，Spain V A.Soil Ecology.New York:Kluwer Academic Publishers，2001.

［14］Paul B K，Lubbers I M，van Groenigen J W.Residue incorporation depth is a controlling factor of earthworm-induced nitrous oxide emissions.Global Change Biology，2012，18(3):1141-1151.

［15］Cao Z P，Qiao Y H，Wang B Q，Chu Q.Impact of soil fertility maintaining practice on earthworm population in high production agro-ecosystem in North China.Acta Ecologica Sinica，2004，24(10):2302-2306.

［16］Yu J G，Li H X，Chen X Y，Hu F.effects of straw application and earthworm inoculation on soil labile organic carbon.Chinese Journal of Applied Ecology，2007，18(4):818-824.

［17］Zhen X H，Wang M X，Wang Y S，Shen R X，Gong Y B，Luo D M，Zhang W，Jin J S，Li L T.Impact of soil humidity on N2O production and emission from a rice-wheat rotation ecosystem.Chinese Journal of Applied Ecology，1996，7(3):273-279.

［18］Borken W，Grundel S，Beese F.Potential contribution of Lumbricus terrestris L.to carbon dioxide，methane and nitrous oxide fluxes from a forest soil.Biology and Fertility of Soils，2000，32(2):142-148.

［19］Parkin T B，Berry E C.Microbial nitrogen transformations in earthworm burrows.Soil Biology and Biochemistry，1999，31(13):1765-1771.

［20］Devliegher W，Verstraete W.The effect of Lumbricus terrestris on soil in relation to plant growth:effects of nutrient-enrichment processes(NEP)and gut-associated processes(GAP).Soil Biology and Biochemistry，1997，29(3/4):341-346.

［21］Drake H L，Horn M A.As the Worm Turns:The Earthworm Gut as a Transient Habitat for Soil Microbial Biomes.Annual Review of Microbiology，2007，61:169-189.

［22］Edwards C A，Bohlen P J.Biology and Ecology of Earthworms，3rd edn.London:Chapman and Hall，1996.

［23］Fonte S J，Kong A Y Y，van Kessel C，Hendrix P F，Six J.Influence of earthworm activity on aggregate-associated carbon and nitrogen dynamics differs with agroecosystem management.Soil Biology and Biochemistry，2007，39(5):1014-1022.

［24］Li H X，Hu F，Shen Q R，Chen X Y，Cang L，Wang X.Effect of earthworm inoculation on soil carbon and nitrogen dynamics and on crop yield with application of corn residues.Chinese Journal of Applied Ecology，2002，13(12):1637-1641.

［25］Malhi S S，Lemke R.Tillage，crop residue and N fertilizer effects on crop yield，nutrient uptake，soil quality and nitrous oxide gas emissions in a second 4-yr rotation cycle.Soil and Tillage Research，2007，96(1/2):269-283.

［26］Sheehan C，Kirwan L，Connolly J，Bolger T.The effects of earthworm functional group diversity on nitrogen dynamics in soils.Soil Biology and Biochemistry，2006，38(9):2629-2636.

［27］Wang X，Hu F，Li H X，Shen Q R.Effects of earthworm on soil C，N on upland-rice soil under different manipulations of corn straw.Ecology and Environment，2003，12(4):462-466.

［28］James P C，Olaf S.The feeding ecology of earthworms-a review.Pedobiologia，2007，50(6):463-477.

参考文献:

［2］韩兴国，王智平.土壤生物多样性与微量气体(CO2，CH4，N2O)代谢.生物多样性，2003，11(4):322-332.

［4］罗天相，李辉信，王同，胡锋.线虫和蚯蚓对土壤微量气体排放的影响.生态学报，2008，28(3):993-999.

［9］高波，傅声雷，张卫信，刘素萍，周存宇.蚯蚓和三叉苦对亚热带人工林土壤N2O和CH4通量的短期效应.热带亚热带植物学报，2010，18(4):364-371.

［15］曹志平，乔玉辉，王宝清，徐芹.不同土壤培肥措施对华北高产农田生态系统蚯蚓种群的影响.生态学报，2004，24(10):2302-2306.

［16］于建光，李辉信，陈小云，胡锋.秸秆施用及蚯蚓活动对土壤活性有机碳的影响.应用生态学报，2007，18(4):818-824.

［17］郑循华，王明星，王跃思，沈壬兴，龚宴邦，骆冬梅，张文，金继生，李老土.稻麦轮作生态系统中土壤湿度对N2O产生与排放的影响.应用生态学报，1996，7(3):273-279.

［24］李辉信，胡锋，沈其荣，陈小云，仓龙，王霞.接种蚯蚓对秸秆还田土壤碳，氮动态和作物产量的影响.应用生态学报，2002，13(12):1637-1641.

［27］王霞，胡锋，李辉信，沈其荣.秸秆不同还田方式下蚯蚓对旱作稻田土壤碳氮的影响.生态环境，2003，12(4):462-466.