申瑞瑞, 李亚柯, 王伯华



红茶菌发酵液抑菌活性的研究

申瑞瑞1, 李亚柯1, 王伯华*2

(1. 湖南文理学院 芙蓉学院, 湖南 常德, 415000; 2. 湖南文理学院 生命科学学院，湖南 常德，415000)

红茶菌发酵液是由茶糖水发酵制成的茶饮料, 红茶菌膜为细菌、酵母和真菌组成的共生菌. 红茶菌发酵液成分比较复杂, 采用纸片法和牛津杯法测试了K-A红茶菌发酵液对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌效果, 结果显示它对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用. 抑菌活性主要由有机酸和某种对热敏感的物质提供. 研究还发现不同来源的K-A红茶菌和K-H红茶菌发酵特征差异显著.

红茶菌; 发酵液; 抑菌活性

红茶菌(Kombucha)是一种由酵母菌、醋酸菌和乳酸菌组成的共生菌, 用它发酵茶糖水可以制成略带甜酸风味的茶饮料[1], 其是我国一种历史悠久的民间传统饮料. 近年来, 对红茶菌保健功能的研究发现它具有增强机体免疫力、促进消化等功能[2—3]. 近年来, 科研人员都将其作为天然产物的资源库加以开发利用[4].

本研究以K-A红茶菌为研究对象, 测试其发酵液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果, 并初步分析抑菌物质的耐热性. 同时比较了不同来源的K-A红茶菌和K-H红茶菌的发酵特征, 以期为红茶菌发酵液中抑菌活性物质的开发利用提供理论依据.

1 材料

1.1 菌种

红茶菌K-A购自安徽省; 红茶菌K-H购自黑龙江省; 供试菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均由湖南文理学院生命科学学院微生物实验室从腐败的食品中分离获取并保藏.

1.2 菌种培养

红茶菌的培养[5]: 在沸水中加入0.5%的红茶, 浸泡10 min后滤渣, 加入10%的蔗糖, 121 ℃灭菌15 min即得茶糖水, 冷却后接入一小块红茶菌菌膜, 30 ℃培养7～10 d.

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的培养: 均采用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂2%), 37℃培养3～5 d.

1.3 主要仪器

pH测定仪(pH3110)、超净工作台(SW-CJ-IF*)、低速离心机(TDL-40B*)、手提式压力蒸汽灭菌器(YX280B*)、旋转蒸发器(RE-52C)、电热恒温干燥箱(DHG-9140)、电热恒温水浴锅(HH-S4).

2 方法

2.1 供试菌菌悬液的制备

从大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的斜面培养基上用接种环适量挑取几环菌体, 加到牛肉膏蛋白胨液体培养基中, 置于37 ℃培养箱180 rpm振荡培养24 h, 将菌悬液的OD480 nm调整至0.5～0.6后备用[6].

2.2 抑菌试验

2.2.1 滤纸片法

用打孔器把滤纸片打成直径为6 mm的滤纸片, 灭菌后分别吸取待测液体, 然后用无菌镊子把滤纸片放在涂布有供试菌悬液的培养基上, 置于37 ℃的恒温培养箱中培养36～48 h, 观察抑菌圈的大小并做记录.

2.2.2 牛津杯法

把已灭过菌的牛津杯用镊子固定在涂布有一定量供试菌悬液的培养基上, 分别向牛津杯中加入100 μL的待测液体, 置于37 ℃的恒温培养箱中培养36～48 h, 观察抑菌圈的大小并做记录.

2.3 红茶菌发酵液的热处理

用试管取一定量培养至第8天的红茶菌发酵液, 放入100℃的水浴锅内进行热处理15 min, 使发酵液中的蛋白质变性.

2.4 红茶菌发酵液的浓缩

取培养至第8天的红茶菌发酵液, 4 000 rpm离心5 min, 取上清液用旋转蒸发器在50 ℃条件下将发酵液浓缩至原体积的一半.

3 结果

表1 K-A红茶菌发酵液对3种细菌的抑菌效果

3.1 红茶菌发酵液对供试细菌的抑制作用

取培养8 d的K-A红茶菌发酵液, 采用滤纸片法和牛津杯法分别对大肠杆菌(G-)、枯草芽孢杆菌(G+)、金黄色葡萄球菌(G+)进行抑菌试验, 实验结果如表1所示. 从表1可知, K-A红茶菌液对3种供试细菌有明显地抑制作用, 说明红茶菌发酵液对G+细菌、G-细菌均有抑制作用. 从表1还可看出牛津杯法抑菌试验中对抑菌圈的观察效果比滤纸片法更显著, 所以后续抑菌试验均采用牛津杯法进行.

3.2 红茶菌发酵液中抑菌物质的初筛

红茶菌发酵液成分复杂, 且含部分具有抑菌活性的物质, 如红茶水中的茶多酚[7], 发酵过程中产生的乙酸等有机酸. 为了寻找K-A红茶菌发酵过程中是否产生了其它潜在的抑菌成分, 将未发酵的茶糖水、相同pH值的乙酸溶液与K-A红茶菌发酵液做了如下对照试验, 结果见表2.

从表2可以看出, 本实验中不经发酵的茶糖水对供试菌都没有抑制作用, 排除了茶水中含有抑菌物质, 有研究指出红茶菌发酵所用的茶糖水中所含的茶多酚具有抑菌效果, 这可能与制备茶糖水时所采用的茶叶品种有关[8].

表2 K-A红茶菌发酵液与茶糖水及相同pH值的醋酸溶液抑菌效果比较

试验所用的红茶菌液为发酵8 d的菌液(pH = 2.4), 由于有机酸的酸碱平衡常数相差较大, 故采用了与红茶菌液相同酸度的冰醋酸溶液进行试验. 从表2可以看出, 2者的抑菌作用较相近, 冰醋酸的抑菌作用略强, 这与冰醋酸本身就具有较强的抑菌效果有关[9], 和谢俊杰的研究结果一致[4].

3.3 红茶菌发酵液中抑菌物质的热稳定性分析

对红茶菌发酵液进行100 ℃热处理15 min以钝化可能存在的热敏性抑菌物质. 用热处理及未经热处理的红茶菌发酵液分别对供试菌做抑菌试验, 结果如表3所示.

表3 K-A红茶菌发酵液热处理前后抑菌效果比较

从表3可以观察到经过热处理的红茶菌发酵液的抑菌圈明显小于未经热处理的发酵液, 由于发酵液中的酸性物质被挥发出来, 所以红茶菌发酵液中存在对热敏感的抑菌物质, 可能是多肽类或蛋白质类物质, 这与Sreeramulu G和张虎成的研究结果是一样的[10—11].

3.4 热处理的红茶菌发酵液浓缩后的抑菌效果

通过旋转蒸馏法将热处理的红茶菌发酵液体积浓缩至原来的1/2, 用NaOH(1 mol/L)调整pH值至与原发酵液一致, 所得浓缩发酵液对3种供试细菌进行抑菌试验, 试验结果如表4所示.

表4 热处理的K-A红茶菌发酵液浓缩前后抑菌效果比较

将热处理的红茶菌发酵液浓缩后, 观察到其对3种供试细菌的抑菌圈明显增大, 结合3.3节中的结果—经热处理的红茶菌液对供试菌的抑菌圈明显减小, 酸性物质被挥发, 可以推断红茶菌发酵液中存在着除有机酸之外的抑菌活性物质, 且该抑菌物质对热敏感.

3.5 不同地区的红茶菌发酵特征比较

红茶菌是由醋酸菌、酵母菌和乳酸菌等多种微生物组成的共生菌, 也有研究报道用于发酵培养红茶菌的微生物主要是醋酸菌和酵母菌, 未分离到乳酸菌[12]. 本试验收集到了安徽省和黑龙江省的红茶菌菌膜, 并对它们的发酵特征进行了比较, 具体见表5. 从表5中可以看出, 不同来源的红茶菌发酵特征差异很大, 说明其微生物组成存在差异, 也暗示了它们在发酵过程中产生的代谢产物各不相同.

表5 K-A红茶菌和 K-H红茶菌发酵特征比较

4 讨论

K-A红茶菌发酵茶糖水8 d后对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌作用, 而未经发酵的茶糖水没有显示出抑菌活性, 表明红茶菌发酵液中的确存在抑菌物质, 这与谢俊杰等[4]人的研究结果相同. 通过热处理试验和低温浓缩试验发现红茶菌发酵液中可能存在对热敏感的抑菌活性物质, 例如多肽类或蛋白类物质, 这为进一步研究红茶菌发酵液中的抑菌物质明确了方向.

试验还比较了源自安徽省和黑龙江省的红茶菌种, 发现它们的发酵特征及抑菌活性差异很大. 收集更多区域的红茶菌种, 测试它们的抑菌效果, 寻找更多的可能应用于食品防腐的抑菌物质, 是下一步的研究方向.

[1] Aidoo K E, Rob Nout M J, Sarkar P K. Occurrence and function of yeasts in Asian indigenous fermented foods[J]. FEMS Yeast Research, 2006, 6(1): 30—39.

[2] 周帼萍, 汪芳安, 高冰. 醋酸菌筛选培养基的优化和优良醋酸菌分离的研究[J]. 中国酿造, 2004(6): 18—19.

[3] Steinkraus K H, Shapiro K B, Hotchkiss, et al. Investigations into the antibiotic activity of tea fungus/kombucha beverage[J]. Acta Biotechnol, 1996, 16: 199—205.

[4] 谢俊杰, 钟青萍, 佘世望, 等. 红茶菌液抑菌作用的研究[J]. 食品科技, 2000(6): 59—60.

[5] 袁洪业. 保健饮料—海宝茶菌[M]. 北京: 轻工业出版社, 1981: 57—60.

[6] 贾彩凤, 王雪梅, 刘敏, 等. 抗生素效价测定实验的几点改进[J]. 生物学通报, 2008, 43(10): 48—49.

[7] 阎守和. 速溶茶生物化学[M]. 北京: 北京大学出版社, 1990: 24—25.

[8] Battikh H, Chaieb K, Bakhrouf A, et al. Antibacterial and antifungal activities of black and green kombucha teas[J]. Journal of Food Biochemistry, 2013, 37(2): 231—236.

[9] 刘胜贵,陈鸠鸠, 李军, 等. 羊耳菊有机溶剂提取物的抑菌作用研究[J]. 辽宁中医杂志, 2010, 37(3): 398—400.

[10] Sreeramulu G, Zhu Y, Knol W. Characterization of antimicrobial activity in Kombucha fermentation[J]. Acta Biotechnolo- gica, 2001, 21(1): 49—56.

[11] 张虎成, 范海涛, 杨国伟, 等. 红茶菌发酵液抑菌活性研究[J]. 安徽农业科学, 2012, 40(9): 5340—5342.

[12] Liu C H, Hsu W H, Lee F L, et al. The isolation and identification of microbes from a fermented tea beverage, HaiPao, and their interactions during Haipao fermentation[J]. Food Microbiology, 1996, 8(13): 407—415.

On antibacterial activities of Kombucha fermentation

SHEN Rui-rui1, LI Ya-ke1, WANG Bo-hua2

(1. Furong College of Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China; 2. College of Life Sciences, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China)

Kombucha fermentation is a beverage obtained by the fermentation of sweetened tea. It’s fermented by a symbiotic culture of bacteria, yeast and fungi. Its chemical composition is complex. K-A kombucha fermented culture showed large inhibition zones against,andby paper disk method and oxford cup method. The results showed that it had evident inhibition effect on growth of both G+bacteria and G-bacteria. And it was found that the antibacterial activity observed is due to not only organic acids, but also other thermosensitive components. The fermentation traits differences between K-A kombucha and K-H kombucha were significant.

Kombucha; fermentation broth; antibacterial activities

10.3969/j.issn.1672-6146.2013.04.007

Q 934

1672-6146(2013)04-0029-04

email: wangbohua0731@yahoo.com.cn;

email: 412003811@qq.com.

2013-10-31

湖南文理学院2012年度大学生创新创业研究项目及湖南省“十二五”重点建设学科资助

(责任编校: 江 河)