姚金光　解继胜　李俊等

[摘要] 目的 以舌癌Tca8113M1细胞系单细胞培养建系为基础，观察Tca8113M1细胞系中舌癌干细胞存在的现象及其相关标志的变化规律。方法 选取Tca8113M1细胞系，以有限稀释法进行体外单细胞培养并建立细胞亚系，在证实其成瘤性的基础上，进一步采用流式细胞术检测癌干细胞相关标志CD44、CD184、细胞外可溶性抗原（ESA）的表

达情况，着重观察单个细胞培养形成细胞克隆的形态与时间。结果 以有限稀释法获取192个Tca8113M1舌癌单个细胞，在96孔板中进行体外培养，获取12个细胞亚系（获取比例为6.25%），均有高成瘤性。癌干细胞相关标志CD44

与ESA均为高水平表达，而CD184表达则在12个细胞系之间有差异。在单个细胞培养中，形成完全克隆、部分克隆与旁克隆3种形态，12个细胞亚系均源于单个细胞形成的完全克隆，均可进行连续传代与扩增，而部分克隆与旁克隆则在后续培养中逐渐衰老与消亡。结论 Tca8113M1细胞系中可能存在癌干细胞，而单细胞培养可形成完全克隆并建立细胞亚系，是进行舌癌干细胞后续研究重要的细胞培养模式。

[关键词] 单细胞； 有限稀释法； 舌癌干细胞； 完全克隆

[中图分类号] Q 21 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.021 癌干细胞是癌组织中一小群具有干细胞特性的细胞，具有自我复制与更新的能力，而且增殖与分裂能力极强，少量细胞即可形成体外移植瘤[1]。近年

有关肿瘤发生、转移、耐药与复发等诸多难题均从癌干细胞的角度进行研究。这种研究的基础和前提是明确癌干细胞的标志或分离出癌干细胞，以提供研究的靶细胞。目前已发现多种永生性癌细胞系中存在有癌干细胞，Tca8113M1舌癌细胞系同样可能存在有癌干细胞，可以作为舌癌干细胞的研究对象。鉴于癌干细胞独特的自我复制与更新能力，本研究以Tca8113M1舌癌细胞系为研究对象，采用有限稀释法分离出单个舌癌细胞进行体外培养，利用癌干细胞的自我复制能力进行分裂增殖，形成预期的单细胞克隆，进一步形成细胞亚系，以此证明Tca8113M1

舌癌细胞系中存在癌干细胞的可能性，同时检测细胞亚系癌干细胞标志的表达情况，观察不同细胞亚系的生物学特性，并且动态观察单细胞培养中细胞克隆形成的规律，为从Tca8113M1细胞系中分离舌癌干细胞提供前期实验依据。

1 材料和方法

1.1 舌癌细胞系来源

人舌癌细胞系Tca8113由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤生物实验室建系，四川大学华西口腔医院赠送。右江民族医学院肿瘤分子生物学实验室在此基础上建立了转移人舌癌细胞系Tca8113M1[2]。

1.2 主要试剂和仪器

胎牛血清（Hyclone公司，美国），RPMI1640培

养基（Gibco公司，美国）；PE标记抗人CD44抗体，异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的抗人细胞外可溶性抗原（extracellular soluble anti-

gen，ESA）抗体，PE/cy5标记抗人CD184抗体，同

型对照抗体分别为大鼠IgG2bκ2、小鼠IgG1与小鼠IgG2aκ4。CO2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪（BD公司，美国），倒置显微镜（Olympus公司，日

本）。

1.3 体外单细胞培养、建系及细胞克隆生长的动态

观察

采用有限稀释法进行体外单细胞培养与建系。Tca8113M1细胞经复苏后，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。用0.25%胰蛋白酶消化细胞制备细胞悬液，转移至96孔板，采用有限稀释法保证每个孔有1个细胞，在倒置显微镜下观察其生长和增殖情况，待其生长成多个细胞克隆后，用0.25%胰蛋白酶消化转移至6孔板扩增培养后，在培养瓶中反复传代建立细胞亚系。此外，在此培养过程中动态观察单个细胞形成细胞克隆的形态与生长情况，观察时点分别为3 d和1、2、3周。

1.4 舌癌细胞亚系成瘤性检测

建立裸鼠皮下移植瘤模型。体外培养Tca8113、Tca8113M1、Tca8113M1舌癌细胞亚系细胞，选取形态良好的生长期细胞，在生长旺盛时接种。具体步骤如下：消化收集舌癌细胞，800 r·min-1离心3～

5 min，弃上清液，计数细胞总量，以含10%胎牛血清的DMEM培养液按每毫升1×107个细胞的密度稀释细胞；消毒裸鼠右腋窝的皮肤，将细胞接种于皮下，以皮下结节直径超过1.0 cm为成瘤标准。共接种裸鼠45只，具体分组如下：1）Tca8113M1舌癌细胞亚系组，共12个亚系，每组3只，共36只；2）Tca8113M1舌癌细胞组，6只，为母系细胞系对照组；3）Tca8113舌癌细胞组，3只，为来源细胞系对照组。

1.5 流式细胞术检测舌癌细胞亚系癌干细胞相关标

志CD44、CD184、ESA的表达情况

将舌癌细胞（密度为每毫升1×106个）消化以后，800 r·min-1离心5 min，弃上清液，加入D-hanks液重悬，尽量将细胞吹散，将细胞悬液分别移入试管中（每管体积为500 μL），设置对照管和样本管。在对照管中加入同型对照抗体（分别是大鼠IgG2bκ2、小鼠

IgG1与小鼠IgG2aκ4）各5 μL，在样本管中加入荧光抗体（PE标记抗人CD44、FITC标记抗人ESA、PE/cy5

标记抗人CD184）各5 μL，置于避光环境下室温孵育30 min，然后于流式细胞仪上检测CD44、CD184、ESA的表达情况。

2 结果

2.1 Tca8113M1细胞体外单细胞建系培养

Tca8113M1单细胞培养12 h后，细胞贴壁；24 h后部分细胞出现变大变薄、空泡样变等老化现象；3 d后，有7个孔的细胞出现增殖分裂现象；7～10 d后有12个孔的细胞开始增殖为单个或数个完全细胞克隆（克隆形成过程见图l）。

培养4～6周后，细胞基本达到稳定生长并增殖的状态，以癌细胞的克隆样生长为主，细胞呈铺路石状，可见巨核、多核细胞，核分裂象多见。待培养孔接近80%铺满时，将细胞转移至6孔板上扩增培养，1～2周后转移至培养瓶中继续传代培养，稳定传代30代后冻存。本研究以有限稀释法获取192个Tca8113M1舌癌单细胞，并在96孔板中进行体外传代建系培养，获取12个细胞亚系，比例为6.25%，分别命名为Tca8113-S1～Tca8113-S12。

2.2 Tca8113M1细胞体外单细胞培养形成细胞克隆

的动态观察

以3 d和1、2、3周为观察时点，发现单个细胞形成细胞克隆的形态主要有3种：完全克隆、部分克隆、旁克隆。Tca8113-S1～Tca8113-S12细胞亚系的细胞均源于单个细胞形成的完全克隆，均可以进行连续传代与细胞培养扩增，而其他单个细胞培养形成的部分克隆与旁克隆则在后续培养中逐渐衰老与消亡，未能连续传代进行细胞扩增。3种克隆在培养过程中的变化情况如下。1）完全克隆：细胞之间紧凑密集成型，增殖速度快，其中1～2周为典型的完全克隆状，3周时在细胞克隆中央出现细胞重叠生长现象（图2中A1～A4）；2）部分克隆：克隆形态界于旁克隆与完全克隆之间，细胞间较疏松，其中1～2周为典型的部分克隆状，但第3周细胞克隆疏松，形状消散，

有转变为旁克隆的趋势（图2中B1～B4）；3）旁克隆：

细胞间疏松不成型，第1周较典型，第2、3周后细胞老化（图2中C1～C4）。

2.3 Tca8113M1舌癌细胞亚系成瘤情况

将舌癌细胞亚系Tca8113-S1～Tca8113-S12接种于裸鼠皮下后，1周后可触及皮下结节，表面光滑、质硬、可活动；2周后可见皮下结节生长迅速；3～4周后皮下结节最大直径达1.0 cm以上。含对照组在内的45只裸鼠均接种成瘤，成瘤率为100%。

2.4 流式细胞术检测细胞亚系癌干细胞相关标志

CD44、CD184、ESA表达情况

流式细胞术检测结果见表1：除了Tca8113-S1、Tca8113-S6与Tca8113-S10的ESA阳性表达率分别为60.7%±3.6%、74.1%±1.5%与65.3%±2.8%外，其余细胞亚系ESA的阳性表达率均在80%以上；各亚系CD44阳性表达率均很高，除了Tca8113-S7为68.9%±2.4%外，其余亚系的阳性率均在90%以上；12个亚系的CD184表达存在差异，阳性率在14.8%±3.5%至74.4%±1.5%之间波动。

3 讨论

本研究利用有限稀释法等经典的细胞培养技术，以舌癌Tca8113M1细胞系为研究对象，随机选取192个舌癌细胞，在96孔板中进行单细胞培养，经过长期传代培养，共建立12个舌癌Tca8113细胞亚系，比例为6.25%，而且都具备很强的成瘤性。进一步检测12个Tca8113细胞亚系的癌干细胞相关标志，结果发现：CD44与ESA均为高水平表达，阳性表达率多在90%左右，而CD184的阳性表达率则各有不同。据此结果可以结合癌干细胞的生物学特性对本实验获得的细胞系进行分析。

本研究发现：舌癌Tca8113M1细胞系中有6.25%的单个细胞可以进行自我分裂、增殖，形成细胞亚系。还有研究[3]发现：Tca8113细胞连续经过两次单细胞培养实验，其中具备分裂增殖活性的细胞比例为5.09%～10.85%。这提示即使在永生化细胞系中，具备持续增殖能力的细胞占整个群体的比例都较少。根据目前的文献[4]报道，在癌细胞群或组织中，癌干

细胞比例为0.01%～5%；体外培养的永生化癌干细胞系中，癌干细胞的比例可能偏高一些。本研究采用经典的有限稀释法获取单个细胞，这种细胞表现出强大的增殖与分裂活力，而且还形成了成瘤性很强的细胞亚系。这些单个培养的细胞是否就是癌干细胞尚需进行单细胞水平的鉴定，但可以大胆推测的是，其中应该包含有癌干细胞。肿瘤干细胞的概念于20世纪60年代提出，并据此建立了肿瘤细胞克隆实验。本研究在单个细胞培养中也发现，单细胞的增殖方式是克隆样增殖，即形成一个细胞克隆后扩大生长，并且在周围形成小的细胞克隆，最后融合成片，但究其细胞来源就是一个癌细胞而已，所有后续的细胞克隆与癌细胞就是源于它，所以可以认为该细胞具有癌干细胞的潜质，可以考虑从癌细胞系中筛选癌干细胞。

在12个Tca8113细胞亚系中，为明确其癌干细胞相关标志的表达情况，为后续舌癌干细胞的筛选提供前期实验数据，本研究综合文献报道，选取了CD44、ESA与CD184等癌干细胞相关标志进行检测。CD44是乳腺癌、头颈部肿瘤、结肠癌等上皮组织的癌干细胞的相关标志，CD184是胰腺癌干细胞的相关标志；ESA则是上皮来源的癌干细胞标志，而且属于细胞黏附分子[5-6]。在本研究建立的12个细胞亚系中，

CD44与ESA均处于高水平表达，而CD184的表达则高低不一，其中亚系间均数差值最大者接近60%。从这3个指标的表达情况来分析，可以进行如下推测：1）CD44与ESA是不同细胞亚系共有的标志，提示这些细胞亚系可能具有共同的组织起源；2）CD184的差异性表达提示Tca8113细胞系中存在细胞异质性，但从其比例来看，大致有3个等级，即15%、30%、50%以上，提示其生物学特性可能有明显的差别，但可作为舌癌干细胞研究的候选细胞群体进行研究。

此外，在单个细胞培养基础上建立细胞亚系的过程中，笔者发现单个细胞形成细胞克隆的形态与细胞最后成系关系密切。在单个细胞形成完全克隆、部分克隆以及旁克隆等3种克隆形式中，只有完全克隆能够形成细胞亚系，而且这些细胞亚系表现出肿瘤的异质性与成瘤性，而部分克隆以及旁克隆则在传代与扩增培养过程中逐渐老化或消亡。这一结果可进行逆向推理：将最初形成完全克隆的12个细胞确定为舌癌干细胞，而其形成的完全克隆则是癌干细胞自我更新与增殖的结果，其中可能富含癌干细胞。这一观点也为前列腺癌、小鼠肉瘤、胰腺癌以及神经胶质瘤等相关研究[7-12]所证实。这些研究发现完全克隆细胞可以高表达癌干细胞标志；接种1 000个完全克隆前列腺癌细胞就可形成移植瘤；通过悬浮球培养的癌细胞球在消化后进行单细胞培养，可以形成高比例的完全克隆。有学者[13]进一步在头颈肿瘤细胞系中发现，CD133与CD44阳性表达的癌细胞多形成完全克隆，而CD133与CD44阴性的癌细胞则多趋向于形成部分克隆或旁克隆，从而认为CD133与CD44是头颈肿瘤癌干细胞的标志。由此可见，完全克隆为癌干细胞的自我更新方式与富集、纯化癌

干细胞及癌干细胞标志的研究提供了新的途径，近年在癌干细胞研究中逐渐被应用和关注[11]。此外，针对完全克隆的研究切入时间与方式也需要注意。在本研究中，典型的完全克隆在单个细胞培养1～2周时形成，最好不要超过3周；扩增培养后，可使癌干细胞比例减少或分化细胞比例增加，从而影响对癌干细胞行为学的观察。

本研究属于寻找舌癌干细胞的前期性和阶段性实验，但是结果很有意义，这12个细胞亚系表明了Tca8113M1细胞系中有存在舌癌干细胞的可能性，而其最初的来源细胞系Tca8113也应存在癌干细胞。结合细胞克隆形态分析的单个癌细胞培养模式可为深入研究舌癌干细胞提供细胞研究平台。

[参考文献]

[1] Tan BT， Park CY， Ailles LE， et al. The cancer stem cell hypo-

thesis： A work in progress[J]. Lab Invest， 2006， 86（12）：1203-

1207.

[2] 姚金光， 邝晓聪， 温冠媚， 等. 舌鳞状细胞癌淋巴道转移裸鼠模

型建立的实验研究[J]. 右江医学， 2006， 34（6）：581-583.

Yao Jinguang， Kuang Xiaocong， Wen Guanmei， et al. Establish-

ment of the tongue squamous cell carcinoma lymphatic metastasis

model of the nude mouse[J]. Youjiang Medical J， 2006， 34（6）：

581-583.

[3] 王开， 康非吾， 闵睿， 等. Tca8113细胞系单细胞体外增殖的实

验观察[J]. 口腔颌面外科杂志， 2008， 18（6）：398-401.

Wang Kai， Kang Feiwu， Min Rui， et al. Proliferation potentials of

Tca8113 cell line in human tongue squamous carcinoma[J]. J Oral

Maxillofac Surg， 2008， 18（6）：398-401.

[4] Jordan CT， Guzman ML， Noble M. Cancer stem cells[J]. N Engl

J Med， 2006， 355（12）：1253-1261.

[5] Woodward WA， Sulman EP. Cancer stem cells： Markers or bio-

markers[J]. Cancer Metastasis Rev， 2008， 27（3）：459-470.

[6] Hermann PC， Huber SL， Herrler T， et al. Distinct populations of

cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity

in human pancreatic cancer[J]. Cell Stem Cell， 2007， 1（3）：313-

323.

[7] Locke M， Heywood M， Fawell S， et al. Retention of intrinsic stem

cell hierarchies in carcinoma-derived cell lines[J]. Cancer Res，

2005， 65（19）：8944-8950.

[8] Biddle A， Liang X， Gammon L， et al. Cancer stem cells in squa-

mous cell carcinoma switch between two distinct phenotypes that

are preferentially migratory or proliferative[J]. Cancer Res， 2011，

71（15）：5317-5326.

[9] Miloszewska J， Gos M， Przybyszewska M， et al. Mouse sarcoma

L1 cell line holoclones have a stemness signature[J]. Cell Prolif，

2010， 43（3）：229-234.

[10] Pfeiffer MJ， Schalken JA. Stem cell characteristics in prostate can-

cer cell lines[J]. Eur Urol， 2010， 57（2）：246-254.

[11] Zhou ZH， Ping YF， Yu SC， et al. A novel approach to the iden-

tification and enrichment of cancer stem cells from a cultured hu-

man glioma cell line[J]. Cancer Lett， 2009， 281（1）：92-99.

[12] Li H， Chen X， Calhoun-Davis T， et al. PC3 human prostate car-

cinoma cell holoclones contain self-renewing tumor-initiating cells

[J]. Cancer Res， 2008， 68（6）：1820-1825.

[13] Zhang S， Balch C， Chan MW， et al. Identification and charac-

terization of ovarian cancer-initiating cells from primary human

tumors[J]. Cancer Res， 2008， 68（11）：4311-4320.

（本文编辑 吴爱华）