于 涛，王晓燕，洪利亚，钟韵山，徐仰仓

(天津市海洋资源与化学重点实验室，天津科技大学海洋科学与工程学院，天津 300457)

海洋约占地球表面积的71%，蕴藏着丰富的生物资源，由于高压、高盐、低营养等特殊环境及海洋物种间的生态作用，再加上遗传和代谢的特异性，使海洋生物产生多种不同于陆地生物的特殊产物．杜氏盐藻是一种广泛分布于海洋、盐湖中的单细胞无壁的真核绿藻[1]，含有丰富的 β–胡萝卜素、黄酮、甘油、维生素 E、亚麻酸、硒、叶酸、多糖等生理活性物质[2]，具有提高人体免疫力、清除自由基、防治肿瘤、心血管、老年性痴呆和白内障等疾病的功能[3]．不同培养条件下，杜氏盐藻体内的生理活性物质含量差异很大．本文研究了含碘盐培养下，杜氏盐藻体内主要生理活性物质含量及清除自由基能力的变化，为提高杜氏盐藻的药用价值提供理论依据．

1 材料与方法

1.1 藻种及培养方法

杜氏盐藻(Dunaliella salina)购自中国科学院水生生物研究所藻种室．将杜氏盐藻藻种接入本次实验所用培养液中培养．

培养液：卤水，取自塘沽盐场，过滤后用蒸馏水稀释盐度至 30‰．一次性添加营养盐至下列浓度：NaNO30.4,mmol/L，尿素 0.2,mmol/L，KH2,PO40.1,mmol/L，柠檬酸铁 0.01,mmol/L，NaHCO33.0,mmol/L．121,℃ 30,min 灭菌．培养温度为 25,℃，光照度为 4,000,lx，光/暗周期为 16,L/8,D．培养时间为 10,d．处理组在培养初始加不同质量浓度的碘酸钾．

1.2 提取及测定方法

1.2.1 β–胡萝卜素的提取及含量的测定

参照张建华等[4]使用的方法，称取盐藻粉 0.5,g，置于 250,mL三角瓶中，加入丙酮–石油醚(体积比为3∶7)100,mL，封口，60,℃水浴浸提 2次，每次60,min，离心分离上清液，合并提取液，减压浓缩至25,mL．在450,nm处测吸光度，并根据标准曲线计算其含量．

1.2.2 黄酮类化合物的提取及含量的测定

1.2.3 维生素E的提取及含量的测定

参照刘树恒[6]使用的方法，用维生素E(Sigma公司，α–生育酚≥96)制作标准曲线．称取盐藻粉0.5,g，加入无水乙醇 50,mL，室温浸提 60,min，9,200,r/min离心5,min，沉淀用50,mL无水乙醇再次提取60,min，合并提取液，减压浓缩至25,mL．10,mL反应体系中包括20,mg/L NH4Fe(SO4)2溶液0.5,mL、pH 4.6的乙酸–乙酸钠缓冲溶液 1.0,mL、样品溶液2.0,mL、5–硝基–1，10–菲咯啉乙醇溶液 1.0,mL、10.0,g/L十六烷基三甲基溴化铵溶液 1.0,mL、H2O 4.5,mL，室温反应10,min．在502,nm处测定吸光度，从标准曲线上查出维生素E含量．

采用核黄素–NBT还原法[7]．核黄素在光照下可以产生·，·可被 NBT 还原形成蓝色物质，后者在 580,nm处有吸光值．3,mL反应体系中含有：提取液 0.1,mL，0.1,mol/L EDTA 0.2,mL，1.5,mmol/L NBT 0.1,mL，磷酸缓冲液(pH 7.8)2.55,mL，0.12,mmol/L核黄素 0.05,mL．25,℃下光照 10,min．在 580,nm 波长处分别测定样品组吸光度(A1)和对照组吸光度(A2)，按照式(1)计算清除率．

1.2.5 羟自由基(·OH)的测定

·OH 由 Fenton反应产生，·OH 的测定采用水杨酸比色法，参照徐仰仓[8]使用的方法．5,mL反应体系中含有：10,mmol/L水杨酸 0.5,mL，0.4,mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)3.0,mL，或 0.4,mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.4)2.8,mL，提取液 0.2,mL，3.8,mmol/L Fe2+–EDTA溶液 0.5,mL，4,mmol/L H2O21,mL．25,℃反应 90,min后，用乙醚抽提 2，3–二羟基苯甲酸，在 510,nm 波长处分别测定样品组吸光度(A1)和对照组吸光度(A2)，按照式(1)计算·OH清除率．

1.3 统计分析

利用t–检验对数据进行分析，每个数据是3次重复实验的平均值．

2 实验结果

2.1 碘酸钾对杜氏盐藻体内黄酮含量的影响

碘酸钾对杜氏盐藻体内黄酮含量的影响如图 1所示．当培养液中碘酸钾的质量浓度低于 2.0,g/L时，杜氏盐藻体内黄酮的含量并没有发生明显的变化；当培养液中碘酸钾质量浓度在 3.0～4.0,g/L时，杜氏盐藻体内的黄酮含量明显高于对照；当培养液中碘酸钾质量浓度为 4.0,g/L时，黄酮含量为对照的126.3%；当碘酸钾质量浓度为5.0,g/L时，黄酮的含量又基本回到对照水平．

图1 碘酸钾对杜氏盐藻黄酮含量的影响Fig.1 Effect of potassium iodate on flavonoid content in dunaliella salina

2.2 碘酸钾对杜氏盐藻体内β–胡萝卜素含量的影响

碘酸钾对杜氏盐藻体内 β–胡萝卜素含量的影响如图 2所示．碘酸钾诱导杜氏盐藻 β–胡萝卜素含量累积的最佳质量浓度为 0.4,g/L，此时，β–胡萝卜素含量为对照的121.6%．此后，随着培养液中碘酸钾质量浓度的增高，藻体内的 β–胡萝卜素含量逐渐降低，碘酸钾质量浓度为 1.0,g/L时，β–胡萝卜素含量为对照的96.8%．

图2 碘酸钾对杜氏盐藻β–胡萝卜素含量的影响Fig.2 Effect of potassium iodate on beta-carotene content in dunaliella salina

2.3 碘酸钾对杜氏盐藻体内维生素E含量的影响

由图 3可见：随着碘酸钾质量浓度的升高，杜氏盐藻体内的维生素 E含量逐渐增高，碘酸钾质量浓度为 0.4,g/L时达到最大值，为对照的 126.7%．此后随着碘酸钾质量浓度的增高，藻体内的维生素 E含量反而降低，当碘酸钾质量浓度为1.0,g/L时，藻体内的维生素E含量降为对照的94.7%．

图3 碘酸钾对杜氏盐藻维生素E含量的影响Fig.3 Effect of potassium iodate on vitamin E content in dunaliella salina

2.4 碘酸钾对杜氏盐藻提取物清除 ·、·OH的影响

以上结果表明，培养液中碘酸钾质量浓度直接影响着杜氏盐藻体内抗氧化剂的含量，其中刺激作用较大的碘酸钾质量浓度为 0.4,g/L和 4.0,g/L．为了进一步验证上述结论，检测不同碘酸钾质量浓度下杜氏盐藻提取液清除·、·OH 能力的变化．核黄素在光照下可以产生·．杜氏盐藻藻粉提取液(50%乙醇提取液)能部分清除反应体系中核黄素产生的·，清除率为 35.6%(图 4)．杜氏盐藻培养在含碘酸钾的溶液中，其提取液清除的能力提高了．碘酸钾质量浓度在 0～1,g/L 时，藻体清除·的能力与体内 β–胡萝卜素和维生素 E含量的变化趋势一致，碘酸钾质量浓度为 0.4,g/L时，清除率最大，达到 59.8%(图4)；碘酸钾质量浓度在 1～5,g/L时，藻体清除·的能力与体内黄酮含量的变化趋势一致，碘酸钾质量浓度为 4.0,g/L时，清除率最大，达到 52.9%(图 4)．观测碘酸钾对杜氏盐藻提取物清除·OH的影响时得到了类似的结果(图5)．

图4 碘酸钾对杜氏盐藻提取物清除·能力的影响Fig.4 Effect of potassium iodate on the· free radical scavenging capacity of dunaliella salina extract

图5 碘酸钾对杜氏盐藻提取物清除·OH能力的影响Fig.5 Effect of potassium iodate on the ·OH free radical scavenging capacity of dunaliella salina extract

3 讨论与分析

已知杜氏盐藻是一种重要的海洋药用植物，含有丰富的 β–胡萝卜素、黄酮、甘油、维生素 E、亚麻酸、硒、叶酸、多糖等生理活性物质，具有提高人体免疫力、清除自由基、防治癌症、心血管、老年性痴呆和白内障等疾病的功能[2–3]．为了进一步提高杜氏盐藻的药用价值，本文以碘酸钾为诱导剂，研究了其对杜氏盐藻抗氧化能力的影响．结果表明，0.4,g/L的碘酸钾能明显提高杜氏盐藻中β–胡萝卜素和维生素E的含量(图 2、图 3)，4.0,g/L的碘酸钾明显提高了杜氏盐藻中黄酮的含量(图 1)．表明培养液中的碘酸钾能提高杜氏盐藻体内抗氧化物质的含量．体外实验也表明碘酸钾增强了杜氏盐藻提取物清除和·OH的能力(图 4、图 5)．

自由基是存在于生物体内的一把双刃剑，在正常浓度范围内，它是机体的一种功能物质，维持着生命活动的正常进行．但当浓度较高时，则对机体有严重的损伤作用，最终导致各种疾病[9]．随着年龄的增大，人体自身清除活性氧自由基的能力降低，体内活性氧的含量逐渐增高．因此，只有借助外来抗氧化物质的帮助，才能维持体内自由基的相对平衡[10]．碘酸钾提高了杜氏盐藻体内抗氧化物质的含量，说明碘酸钾能增加杜氏盐藻的药用价值．

中药材的有效成分常常是一些次生代谢产物，后者是衡量药材品质的一个重要指标．因此设法提高次生代谢产物的含量是中药材研究及生产者追求的目标．除基因工程手段外，改变生存环境也是诱导药用植物次生代谢产物累积的重要措施[11–12]．碘酸钾是一种氧化剂，当植物遭受由它引起的氧化胁迫时，植物体内的一些抗氧化保护系统被诱导，进而产生较多的抗氧化物质来对抗这种氧化胁迫．这可能是外源碘酸钾提高杜氏盐藻黄酮、β–胡萝卜素、维生素 E含量的原因所在．

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