向定朝，王存祖，陆晓峰，欧阳琦

(1.江苏大学临床医学院，江苏 镇江212001;2.苏北人民医院神经外科，江苏 扬州225001;3.江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏镇江212013)

胶质瘤一直是神经外科领域的治疗难题，化疗是胶质瘤术后重要治疗方法之一。目前国际上公认的胶质瘤化疗首选药物是替莫唑胺(temozolomide，TMZ)［1]，但研究显示替莫唑胺也仅能小幅延长患者生存时间，因胶质瘤耐药而不能改善其预后。胶质瘤化疗耐药，是胶质瘤化疗失败和胶质瘤复发的原因。近年来“肿瘤干细胞学说”认为，从胶质瘤中分离出来的胶质瘤干细胞(glioma stem cells，GSCs)具有较强的耐药性，是胶质瘤耐药以及复发的根本原因。为深入了解胶质瘤对替莫唑胺耐药的原因，体外构建人脑胶质瘤耐替莫唑胺U251 细胞株(U251/TMZ)，是研究胶质瘤耐药的基础。本实验通过大剂量冲击法［2]建立胶质瘤耐替莫唑胺细胞模型，并比较U251/TMZ 与亲代细胞U251 之间的生物学特征。

1 材料和方法

1.1 实验材料及主要试剂

人脑胶质瘤U251 细胞株购于上海生命科学研究所细胞库;培养细胞贴壁生长的特级胎牛血清、DMEM 低糖培养基、DMSO、胰酶、青链双抗等购于Gibco 公司;CD133、ABCG2 鼠抗人单抗购于Neo-Markers 公司;CD133(AC133)、羊抗鼠IgG(二抗)、CY3等均购于Miltenyi 公司;ECL 化学发光试剂盒购于Merck Millipore 公司;TMZ、噻唑盐(MTT)等购于Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清的DMEM 培养基培养U251 细胞，置于CO2培养箱内(37 ℃，5%CO2)培养。当细胞铺满培养瓶底壁时进行消化、传代。

1.2.2 药物大剂量冲击法建立U251/TMZ 细胞细胞接种于75 mL 玻璃培养瓶中，贴壁生长至铺满瓶底时，参考我们前期实验及预实验数据［3]，加入120 μmol/L 的TMZ 进行诱导。……